[发明专利]提高丁二酸产量的重组菌及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及提高丁二酸产量的重组菌及构建方法。

背景技术

丁二酸又称为琥珀酸，在生物体中，作为TCA循环过程中重要的中间代谢物,同时也具有重要的应用价值。丁二酸可以作为多种重要化合物的前体原料，如1,4-丁二醇、四氢呋喃等,被广泛应用于食品、医药、化妆品,可降解塑料合成等方面，因此被美国能源部认为是12种最具价值的大宗化学品之一。目前丁二酸主要以不可再生的石油原料，通过化学法合成。由于石油资源的日益枯，利用微生物法产丁二酸引起了人们的极大关注。与化学合成法相比，微生物发酵法具有很多优势，而且由于丁二酸合成过程中吸收CO₂,可以有效减缓温室气体的排放。目前,研究较多的产琥珀酸微生物菌株主要有:Actinobacillus succinogenes（McKinlay et al.,2000），Anaerobiospirillum succiniciproducens（Nghiem et al.,1997），Mannheimia succiniciproducens（Lee et al.,2002）以及Escherichia coli（Vemuri et al.,2005;Jantama et al.,2008a;Jantama et al.,2008b;Zhang et al.,2009a;Zhang et al.,2009b）。其中大肠杆菌E.coli由于其遗传背景明确、易操作、生长速率快、易培养及利用碳源广等诸多优点而受到越来越多的重视，被认为是最有潜力的琥珀酸生产菌株（Jantama et al.,2008a；Vemuri et al.,2002a；Zhang et al.,2009b）。

E.coli在厌氧条件下进行混合酸发酵，主要产生乳酸、甲酸、乙酸以及少量的丁二酸（Clark,1989）。对于丁二酸生产而言，副产物乳酸、甲酸、乙酸等的存在会抑制丁二酸的产量和转化率，也给下游的分离纯化带来困难。因此，需要改变E.coli细胞内的代谢流，抑制上述副产物的生成。先前的研究中，以E.coli W1485为出发菌，利用插入抗性基因的方法同时使乳酸脱氢酶（ldhA）以及丙酮酸甲酸裂解酶（pflB）编码基因失活，获得突变菌株NZN111（Stols et al.,1997）。该菌株由于缺少了Ldh以及PflB，使得乳酸和甲酸的产量显著降低，但是由于扰动导致的细胞体内的氧化还原不平衡，丙酮酸大量积累，使得菌株在厌氧条件下不能以葡萄糖为碳源进行生长。Chatterjee等人发现ptsG基因中的突变使得NZN111突变株能够重新利用葡萄糖生长，发酵产物中丁二酸、乙酸和乙醇的比例为2：1：1（Chatterjee et.,2001）。

磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate(PEP):carbohydrate phosphotransferase systems(PTS)）是大肠杆菌吸收利用葡萄糖的主要方式（Flores et al.,1996;Gosset,2005;Postma et al.,1993;Zhang et al.,2009a）。该系统由可溶性的酶I/Hpr（ptsHI基因编码）以及酶II（包括IIA/B/C，由crr以及ptsG基因编码）组成（Hernandez-Montalvo et al.,2003；Postma et al.,1993；Lu et al.,2011）。在PTS系统中，吸收一分子的葡萄糖需要消耗一分子的PEP，PEP被认为是E.coli中合成若干重要化合物的前体分子，大量PEP用于葡萄糖的吸收对于E.coli化合物合成而言是不经济的，失活PTS系统将有利于提高PEP的供给以及相关目的产物的生成（Flores et al.,1996;Wang et al.,2006;Yi et al.,2003;Zhang et al.,2009b）。