[发明专利]一种荧光探针检测酶活性方法

说明书

技术领域

本发明属于酶分析技术领域，具体地说是涉及一种荧光探针的应用，其可用于检测酶活性。

背景技术

酶是产生于生物体内活细胞的一种生物催化剂，能够高效的催化体内各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。酶是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的化学反应几乎都是在酶的催化下进行。因此对于酶活性的检测在生物技术，生物化学以及临床诊断等领域有着重要意义。

目前常见的检测酶活性的方法包括分光光度法、HPLC分析、电化学分析、化学发光分析、放射法等。分光光度法是利用酶促反应前后底物吸光度的变化求出底物浓度的变化值，从而计算出酶的活性，但该方法需要依靠紫外检测，灵敏度较低，而且酶和底物的消耗大，无法在低浓度下检测酶活性；HPLC分析虽然具有定量分析的优点，但需要较多的样品量，且灵敏度偏低；电化学分析需要偶联多步反应，甚至需要其它酶的参与，使反应体系变得复杂。化学发光分析灵敏度较高，但不易操作，重复性差，难以准确地定量检测酶活性；放射法具有较高的灵敏度，但需要放射性标记的化合物，操作上有一定的危险性。

因此，设计出一种更为灵敏、有效的酶活性检测方法是极为迫切的，而荧光探针作为一种非放射性的标记技术，因其具有较好的安全性和较高的灵敏度，在检测酶的活性方面越来越受到人们关注，该技术通常是将酶的底物设计成双标记分子，即在底物两端共价连接两个不同的染料分子，两个染料分子之间发生能量转移或电子转移，酶作用于底物后两染料分子分开，切断了转移过程，使荧光光谱发生变化。但双标记的成本较高，而且大多底物分子难以双标记修饰，酶的活性也可能受到较大影响，所以此方法也不能广泛地应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克服上述酶活性检测技术的种种不足，从而应用一系列的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物作为荧光探针，使用这种具有高荧光量子产率的聚合物或寡聚物作为荧光探针，并对酶的底物进行单标记，高效、灵敏、定量、直接、简便、快速、灵敏的荧光探针检测酶活性的方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种荧光探针检测酶活性的方法，所述的荧光探针为式I，II 或III所示的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物：

式I

其中，R1代表链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2－12个碳原子的烷基或芳基；

Ar为芴基、苯基、或噻吩基；

式II

其中，R2为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有2－12个碳原子的烷基或芳基；

B为苯二乙烯基（-CH=CH-Ph-CH=CH-）或苯二乙炔基（-C≡C-Ph-C≡C-）。

上述一种荧光探针检测酶活性方法的R1选自下列基团中的一种：2-磺基乙基、4-磺基丁基、6-磺基己基、4-(2-磺基乙氧基)苯基、4-(3-磺基丙氧基)苯基、4-(4-磺基丁氧基)苯基、4-(5-磺基戊氧基)苯基、4-(6-磺基己氧基)苯基、2-羧基乙基、4-羧基丁基、6-羧基己基、4-(4-羧基丁氧基)苯基、6-磷酸基己基。

上述一种荧光探针检测酶活性方法的R2选自下列基团中的一种：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲氧基乙基、2-(2-甲氧基乙氧基)-乙基、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙基、2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙基。

上述一种荧光探针检测酶活性方法为了淬灭式I或II所示的化合物，使用的淬灭剂为：

Ar为芴基或苯基时，或B为苯二乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂；

Ar为噻吩基或B为苯二乙烯基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、吖啶、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。

上述一种荧光探针检测酶活性方法的酶活性定量检测方法包括如下的步骤：

第一步，对酶底物进行化学修饰：通过共价键合，在酶底物上连接一个与荧光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；