[发明专利]一种荧光探针检测酶活性方法

权利要求书

1.一种荧光探针检测酶活性的方法，其特征在于：所述的荧光探针为式I或II所示的水溶性共轭聚合物：

其中，R1为Ar为苯基；

其中，R2为B为苯二乙炔基(-C≡C-Ph-C≡C-)。

2.根据权利要求1所述的一种荧光探针检测酶活性的方法，其特征在于：为了淬灭式I或II所示的化合物，使用的淬灭剂为：

Ar为苯基时，或B为苯二乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。

3.根据权利要求1所述的一种荧光探针检测酶活性的方法，所述的酶活性定量检测方法包括如下的步骤：

第一步，对酶底物进行化学修饰：通过共价键合，在酶底物上连接一个与荧 光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；

第二步，绘制标准检测曲线：将修饰过的酶底物与上述的荧光探针反应，完全淬灭荧光探针的荧光：分批将第一步得到的修饰过的酶底物加入含有荧光探针的缓冲液中，修饰过的酶底物与荧光探针通过静电作用在缓冲液中形成静电复合物并淬灭荧光，直至荧光探针的荧光淬灭至99％以上，记录此过程中酶底物浓度[Q]和荧光强度F，以F0/F-1为纵坐标，[Q]为横坐标，绘制Stern-Volmer淬灭曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系；

该淬灭曲线是直线的情况下，Stern-Volmer方程为：

F0/F-1＝Kapp[Q]

其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，

F是加入酶底物之后的荧光强度，

[Q]是混合液中酶底物浓度，

Kapp是表观系数，为一常数值；

该淬灭曲线是抛物线的情况下，Stern-Volmer方程为：

F0/F-1＝A[Q]+B[Q]²

其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，

F是加入酶底物之后的荧光强度，

[Q]是混合液中酶底物浓度，

A、B为常数；

第三步，待测酶的活性分析：将不同浓度的修饰过的酶底物与荧光探针反应后，分别加入待测的酶，荧光信号随着酶的加入量逐渐恢复，通过荧光发射光谱测定混合液的荧光强度值，然后根据第二步得到的标准检测曲线将荧光强度值转换为底物浓度值，并以此底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线，斜率即为反应初速度；

再以反应初速度的倒数为纵坐标Y，酶底物初始浓度的倒数为横坐标X，绘制Lineweaver-Burk曲线，该曲线接近直线，且符合方程：Y＝61.067+241.90445X，通过斜线的横截距-1/Km求出Km，计算出酶促反应过程中某时刻在溶液中的酶底物的浓度，从而计算酶的活性。