[发明专利]一种纳米微米结构共存壳聚糖双层支架的制备方法

说明书

技术领域

本发明所属技术领域为生物医用材料，涉及一种纳米微米结构共存壳聚糖双层支架的制备方法。

背景技术

组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门交叉科学。它的基本原理和方法是将自体或异体的活细胞诱导分化增殖后,种植到一种具有优良细胞相容性并可以被机体降解吸收的生物材料上面形成复合物，然后将细胞-生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织器官，最终完成受损器官组织的再生。

壳聚糖是一种具有明显碱性和带正电荷的天然多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性，近几十年来在组织工程领域的研究倍受关注，可被制成凝胶、纤维、微球、多孔支架等多种形式，广泛应用于骨、皮肤、神经、肝脏等组织的修复和靶向药物的释放等领域（Jayakumar等， Biotechnology Advances. 2011; 29:322-337；Kim 等，Biotechnology Advances. 2008; 26: 1-21）。但目前制备得到的壳聚糖生物材料多为单一的微观结构，无法适应人体复杂器官和组织的修复，如人体的一些软骨和硬骨接和处的病损修复，需要有同时适合软骨细胞和成骨细胞生长的环境。传统的方法采用天然软骨和骨为原材料，通过脱细胞去除其抗原性，得到同时适合骨和软骨两种组织生长的双层支架（卢世璧等，CN101574540）。另外，CN101219069公开了一种用于骨/软骨修复的双层复合支架，其中模拟骨样层采用聚乳酸和羟基磷灰石的复合支架，模拟软骨样层采用微米多孔的甲壳素、聚乳酸等的单一或复合物支架；CN101327336公开了一种采用静电纺丝技术制备的明胶与3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷复合膜，可用于骨/软骨的修复，但结构上为单层纤维膜。本发明的主要设想是利用壳聚糖材料本身良好的生物相容性，制备一种微观结构上更适合骨/软骨修复的双层支架，其中底层为微米多孔壳聚糖支架，提供高孔隙率和力学强度，适合成骨细胞的生长；表层为壳聚糖纳米纤维膜，提供软骨细胞合适的生长环境，并可有效分割软骨细胞和成骨细胞的生长部位，在支架植入过程中定向修复骨/软骨的缺损。另外，壳聚糖微米多孔支架和壳聚糖纳米纤维膜之间具有良好的连通性，可以保证营养物质和化学信号的传递，从而在多细胞种植的过程中促进各细胞的生长，为骨/软骨修复提供良好的生长空间。

发明内容

本发明专利主要解决的技术问题是制备纳米微米结构共存的壳聚糖双层支架，提供骨/软骨修复的良好空间。制备方法采用复合相分离和静电纺丝的技术。双层壳聚糖支架的制备方法具体如下。

 (1) 配制醋酸水溶液，质量浓度在1-4％之间。

 (2) 称取一定量的壳聚糖，溶解于配制的醋酸溶液中，质量浓度在4-10％之间。搅拌均匀后放入预冷的成型模具中。

 (3) 在－18 ℃条件下，将溶液冷冻12小时以上，制得壳聚糖凝胶。

 (4) 将凝胶在－60 ℃，压力低于30 Pa的条件下冷冻干燥3天，制得基底的微米壳聚糖支架。

 (5) 在温度70 ℃及回流条件下，将一定量的壳聚糖溶解于三氟乙酸中，质量浓度在6-12％之间。

 (6) 将制得的壳聚糖基底支架用导电双面胶贴在铝箔上，铝箔接地。将配制好的壳聚糖三氟乙酸溶液放入一个3 ml的针管中，固定针管和基底壳聚糖支架距离20 cm， 针管通以10-20 kV的高压电，高压静电推动壳聚糖溶液形成纳米纤维贴附在基底壳聚糖支架的表面，纺丝40分钟得到纳米微米结构共存的双层壳聚糖支架。

 (7) 制得的壳聚糖双层支架在0.5 mol/L的氨水溶液中浸泡20分钟，去除支架中残留的醋酸和三氟乙酸，然后用大量蒸馏水冲洗干净，重新冷冻支架，冻干；最后经环氧乙烷消毒后用于细胞培养和组织修复。

制得的双层壳聚糖支架呈白色，孔隙率大于80％，压缩模量随壳聚糖浓度的不同在5-18 MPa之间，与人体骨骼的强度相近。支架具备纳米和微米共存的双层结构，底层的微米壳聚糖支架适合成骨细胞的生长，表层的纳米壳聚糖纤维适合软骨细胞的生长，其微观形貌详见说明书附图1-3。本制备方法简单可行，可用于软骨和硬骨接和处的病损修复。

附图说明

图1：底层微米壳聚糖支架微观结构图。

图2：表层纳米壳聚糖纤维微观结构图。

图3：壳聚糖双层支架剖面结构图。

具体实施方式