[发明专利]经由镁螯合的PCR热启动

说明书

本申请是国际申请日为2007年2月23日的国际申请PCT/EP2007/001585进入中国、申请号为200780006644.X的题为“经由镁螯合的PCR热启动”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及通过执行聚合酶链反应方法(PCR)扩增核酸的技术领域。更精确地，本发明提供了用于执行PCR的新型热启动替代方案，这防止非特异性的引发事件和假扩增产物的产生。

背景技术

伴随核酸扩增和更特别地伴随PCR的主要问题是非特异性扩增产物的产生。在许多情况下，这是由于在其实际的热循环程序前的非特异性寡核苷酸引发和随后的引物延伸事件，因为耐热的DNA聚合酶在环境温度下也是适度活性的。例如，经常观察到由于最终由偶然发生的引物二聚化和后续延伸的扩增产物。为了克服这个问题，本领域众所周知的是进行所谓的“热启动”PCR，其中扩增反应所需的一种组分与反应混合物分开或维持无活性状态，直至反应混合物的温度首次升高。因为聚合酶在这些条件下不起作用，所以在引物无一可以特异性结合的时间段期间不存在引物延伸。为了达到这种作用，已应用几种方法：

a)DNA聚合酶的物理分离

物理分离可以例如通过固体蜡的屏障来获得，所述固体蜡使包含DNA聚合酶的区室与包含大量其他试剂的区室分开。在第一个加热步骤期间，蜡随后自动熔化且流体区室混合(Chou，Q.，等人，Nucleic AcidsRes20(1992)1717-23，US5,411,876)。可替代地，在扩增反应前，DNA聚合酶被亲和固定化在固体支持体上，并且仅通过热介导的释放而释放到反应混合物内(Nilsson，J.，等人，Biotechniques22(1997)744-51)。然而，这两种方法是费时的且不便于执行。

b)DNA聚合酶的化学修饰

对于这种类型的热启动PCR，DNA聚合酶由于化学修饰而可逆地灭活。更精确地，将不耐热的封闭基团引入Taq DNA聚合酶内，这使得酶在室温下无活性(US5,773,258)。这些封闭基团在高温下在前PCR步骤期间被去除，从而使得酶变得活化。此种不耐热的修饰例如可以通过使柠康酐或乌头酐(Aconitric Anhydride)与酶的赖氨酸残基偶联来获得(US5,677,152)。携带此种修饰的酶同时是作为Amplitaq Gold(Moretti，T.，等人，Biotechniques25(1998)716-22)或FastStart DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals)商购可得的。然而，封闭基团的引入是在酶所有空间可利用的赖氨酸残基上任意发生的化学反应。因此，化学修饰的酶制剂的再现性和品质可能有变化且几乎不能加以控制。

c)DNA聚合酶的重组修饰

Taq聚合酶的冷敏感突变体已借助于基因工程进行制备。这些突变体不同于野生型酶之处在于它们缺乏N末端(US6,241,557)。与天然或野生型重组Taq聚合酶形成对比，这些突变体在35℃下是完全无活性的，且因此它们可以在一些情况下用于执行热启动PCR。然而，N末端截短的冷敏感突变体形式需要低盐缓冲液条件，与野生型酶相比较具有较低的持续合成能力且因此仅能用于扩增短靶核酸。此外，因为截短形式缺乏5′-3′外切核酸酶活性，所以它不能用于基于TaqMan检测形式的实时PCR实验。

d)经由核酸添加剂的DNA聚合酶抑制

非特异性退火的引物延伸已显示通过添加短双链DNA片段得到抑制(Kainz，P.，等人，Biotechniques28(2000)278-82)。在这种情况下，引物延伸在低于短双链DNA片段的解链温度的温度下得到抑制，但不依赖对照模板(competitor)DNA自身的序列。然而，过量的对照模板DNA影响核酸扩增反应产量的程度是未知的。

可替代地，可以使用具有导致限定的二级结构的特定序列的寡核苷酸适体。此种适体已使用SELEX技术就对DNA聚合酶的极高亲和力进行选择(US5,693,502，Lin，Y.和Jayasena，S.D.，J Mol Biol271(1997)100-11)。在实际热循环过程自身前扩增混合物内此种适体的存在再次导致与DNA聚合酶的高亲和力结合和随后其活性的不耐热抑制(US6,020,130)。然而，由于选择过程，迄今为止的所有可利用的适体仅能与一个特定种类的DNA聚合酶组合使用。

e)Taq DNA抗体