[发明专利]尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草特有亚硝胺在尿液中的生物标志物理化检验技术领域，具体涉及尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法。

背景技术

烟草特有亚硝胺（TSNAs）是烟草内源性生物碱与硝酸盐和亚硝酸盐通过亚硝化作用而产生，只存在于烟草、烟草制品和卷烟烟气中。近年来，随着吸烟与健康问题受到人们的广泛关注，国内外对于烟气中各种有害化学成分的研究也日益深入。由于烟草特有亚硝胺中的4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基）-1-丁酮(NNK）对动物可能有致癌性，因此，现在烟草行业以及卫生机构等迫切需要建立一种准确评价不同人群对NNK暴露程度的方法，而生物标志物法是一种公认且有效的监测NNK暴露人群暴露程度的方法。

在NNK分子中没有手性碳原子，因此NNK分子没有对映异构体，但NNK分子中有一个羰基，该羰基随着NNK进入人体后被羰基还原酶还原为羟基，生成一对NNAL对映异构体，分别为(S)-NNAL和(R)-NNAL，部分NNAL可以进一步被糖苷化物为NNAL糖苷化合物（包括NNAL-O-Glucuronide和NNAL-N-Glucuronide），这些代谢产物主要通过尿液和其它体液排出体外，研究还发现在吸烟者的尿液中不含游离形式的NNK。

由于人体本身就是一个动态的不对称化学反应有机系统，所以卷烟烟气中的NNK被加氢还原酶还原生成(S)-NNAL和(R)-NNAL的比例以及进一步代谢产物比例必然反映出人体相关器官的解毒能力以及受到NNK的损害程度，因此尿液中(S)-NNAL、(R)-NNAL、(S)-NNAL-糖苷化合物和(R)-NNAL-糖苷化合物的含量以及比例一直受到关注。2002年，Hecht等的研究发现揭示，人体尿样中游离形式的(R)-NNAL的含量略约是(S)-NNAL含量的1.1倍，但人尿样中(R)-NNAL糖苷化合物的含量是(S)-NNAL糖苷化合物含量的的两倍左右，这说明(S)-NNAL和(R)-NNAL的进一步代谢途径差别很大，同时也说明人体对(S)-NNAL有一种立体选择性的保留能力，特别是老鼠在摄入NNK后相当长一段时间内其肺部(S)-NNAL的比例也远高于(R)-NNAL。其他学者的研究结果也显示吸烟的肺癌患者尿样中(S)-NNAL与(R)-NNAL的比值明显大于普通吸烟者。结合流行病学调查分析结果，人们推测人肺脏内可能有(S)-NNAL的受体，此受体可特异性结合(S)-NNAL，这可能就是吸烟吸收NNK导致肺癌的原因之一。

由于中式卷烟每支卷烟烟气中释放的NNK只有几个纳克，而NNK进入人体后又被代谢为多种物质，加之尿样基质复杂，所以尿样中的(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测非常困难，国内外许多相关行业都无法开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作。在这种背景下，许多相关行业迫切需要建立一种能够快速准确测定人体尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量和比例的方法，以便为肺癌的早期检测等提供进一步参考信息。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有方法很难开展尿样中(S)-NNAL和(R)-NNAL的检测工作的不足，提供一种尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法，为评估个体对烟气中NNK的暴露程度提供一种科学的判定方法，该方法具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法，包括以下步骤：

①用测定旋光并比对的方法确定(S)-NNAL和(R)-NNAL的构型并作为参照，或用Mosher方法确定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的构型并作为参照；

②配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合标准溶液，再进行Mosher衍生化，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;用确定构型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通过保留时间确定相应的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯对其相应内标的标准溶液工作曲线；