[发明专利]编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种重组猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白的方法。

背景技术    

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）的主要病原，它不但可以导致断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤（AII，CT）、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合征（PDNS）和呼吸道疾病综合征（PRDS）密切相关。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中流行十分严重，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。在2010年国际猪兽医大会（IPVS）上，猪圆环病毒感染成为关注度最高的疾病，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一。近年来，国内猪圆环病毒感染呈上升趋势。

PCV2含有两个主要的开放阅读框：ORFl和ORF2，ORFl编码两种复制酶蛋白，参与病毒复制；ORF2编码核衣壳蛋白Cap，是病毒主要的免疫原性蛋白。McNeiUy等研究证实Cap蛋白免疫动物可以产生病毒的中和抗体。ORF2基因已经作为研制基因工程疫苗的重点对象。 

众所周知，PCV2的检测是防控PCV2相关疾病的重要组成部分。现行的PCV2检测方法包括有PCR、免疫组化、原位杂交和ELISA技术等。ELISA技术具有高特异性、敏感性，操作简单、方便易行，便于大量样品检测的优点。Cap蛋白作为PCV2主要的免疫原性蛋白，可作为PCV2 ELISA检测的诊断抗原。因此，获得高纯度的Cap蛋白是建立PCV2 ELISA检测的关键。

但是，现有技术中Cap蛋白采用真核表达系统产量低，分离纯化困难；而进行原核表达则多以无活性的包涵体形式存在，所以Cap蛋白难以规模化生产。

发明内容    

本发明的目的是提供一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，易于可溶性表达。

本发明的另一目的是提供含有上述基因的重组表达载体。

本发明的另一目的是提供含有上述基因的重组菌，目的蛋白的表达量高，表达产物易于纯化。

本发明的再一目的是提供含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，该复合物具有良好的免疫原性，生产效率高，易于纯化，制备方法简单，易于规模化生产。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID NO:1所示的序列。

还含有肽聚糖锚钩PA蛋白的编码基因。

所述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3所示。

一种含有上述基因的重组表达载体。

该重组表达载体是将所述基因插入pET-32a的NdeⅠ和XhoⅠ两个酶切位点之间所得。

含有上述基因的重组菌。

所述重组菌是将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21所得。

一种含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物，采用如下方法制备：培养所述重组菌，破碎后获得裂解液上清，纯化后获得含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物。

所述纯化方法为：将乳酸乳球菌用酸煮沸后得到革兰氏阳性增强基质颗粒；将革兰氏阳性增强基质颗粒加入裂解液上清中进行吸附，离心后取沉淀即得所述复合物。革兰氏阳性增强基质颗粒缩写为GEM颗粒。

所述酸为盐酸；革兰氏阳性增强基质颗粒的加入量为：含有0.5～2毫克蛋白的裂解液上清中加入2.5×10⁹个革兰氏阳性增强基质颗粒。

一种所述复合物在制备猪圆环病毒疫苗和猪圆环病毒诊断试剂盒方面的应用。

本发明相对于现有技术方法的有益效果：

1. 本发明将猪圆环病毒2型 Cap蛋白编码基因进行了密码子优化，所以重组猪圆环病毒2型Cap蛋白能够高产、高效、可溶表达，解决了Cap蛋白在真核细胞中表达量低，在原核细胞中表达无活性的难题。由于大肠杆菌原核表达系统比较成熟，所以操作简单。

2. 本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白含有肽聚糖锚钩蛋白PA，可以与GEM颗粒相结合，有利于后续纯化，生产成本低，易于规模化生产。

3. 本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白活性良好，含有该重组蛋白的复合物免疫小鼠后可产生高水平的猪圆环病毒2型特异性抗体。因此，含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的复合物可用于制备猪圆环病毒2型的诊断试剂盒及猪圆环病毒2型亚单位疫苗。

附图说明