[发明专利]一种从光帽鳞伞中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从光帽鳞伞（Pholiota nameko，俗名：滑子菇）中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法。

背景技术

近年来，蘑菇作为中药或功能性食品，在食品和医药行业备注关注。从蘑菇中分离获得的许多活性成分，包括小分子、多糖、蛋白、多糖-蛋白复合物等，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物和免疫调节的作用。其中，有关多糖的研究最为广泛，然而，蘑菇中含量丰富的生物活性蛋白，包括凝集素，真菌免疫调节蛋白，核糖体失活蛋白，抗微生物蛋白，核糖核酸酶和漆酶等，在食品和医药领域的应用上展现出巨大的潜能。

光帽鳞伞（Pholiota nameko）属真菌门，担子菌纲，伞菌目，球盖菇科，鳞伞属。它是一种冬、春季发生的菌盖粘滑的木腐菌，因其菌盖表面有粘液而又被称为滑子菇，是世界上五大宗人工栽培的优质食用菌之一。

光帽鳞伞（Pholiota nameko）具有滑、鲜、嫩、脆的特点，富含有益于人体健康的蛋白质、糖类、矿物元素（钙、磷、铁）、维生素（维生素B₁、B₂、维生素C、烟酸）以及人体所必须的其他各种氨基酸等营养保健物质，是一种低热量的保健食品。据分析，每100g干菇含粗蛋白33.76g、纯蛋白15.13g、脂肪4.05g、总糖38.89g、纤维素14.23g、灰分8.99g。除食用价值外，也具有一定的药用价值。其子实体含丰富的多糖，能够提高机体的免疫力。

目前，除了对光帽鳞伞（Pholiota nameko）生长特性，栽培技术的研究外，对其生物活性的研究主要集中在多糖上，而对其中含量丰富的生物活性蛋白研究尚浅。周蕊等（南京林业大学硕士学位论文2007）从Pholiota nameko菌丝发酵液中分离纯化得到分子量为55KDa的漆酶。Yasuko Kawamura-Konishi等(Biosci.Biotechnol.Biochem.,71(7):1752-1760)从Pholiota nameko子实体中分离纯化得到酪氨酸蛋白酶，分子量约为42KDa。Gui-Ping Guan等（Journal of Bioscience and Bioengineering2011,111(6)：641-645）从Pholiota nameko子实体中分离纯化得到丝氨酸蛋白酶，分子量约为19KDa。漆酶可用于降解木质素，酪氨酸蛋白酶主要用于环境治理包括含有酚类的废水和污染的土壤的处理。而本发明首次从Pholiota nameko中分离纯化得到一种新的具有抗肿瘤活性的蛋白。

发明内容

本发明目的在于提供光帽鳞伞（Pholiota nameko）中的一种抗肿瘤蛋白及其制备方法，该蛋白对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用。

本发明提供的从光帽鳞伞（Pholiota nameko）中提取的抗肿瘤蛋白，分子量为17KDa，N-端氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示序列Ala Gly Arg Thr Phe Ile Gly Tyr Asn Gly，该抗肿瘤蛋白简称为PNAP（Pholiota nameko Anti-tumor protein）。

本发明涉及的光帽鳞伞（Pholiota nameko）中的抗肿瘤蛋白是按照如下方法制备的：

（1）将光帽鳞伞（Pholiota nameko）子实体研磨成粉，溶解于0.2~0.5M的NaCl溶液，2~6℃浸提8~16小时，5000~8000rpm离心20~40min，收集上清液，即光帽鳞伞Pholiota nameko子实体粗提液；

（2）向步骤（1）中的光帽鳞伞（Pholiota nameko）子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为70~100%，2~6℃放置8~16小时，10000~20000rpm离心10~40min，收集沉淀，即光帽鳞伞Pholiota nameko蛋白粗提物；

（3）将步骤（2）中的光帽鳞伞（Pholiota nameko）蛋白粗提物用20~50mM、pH6.0~9.0的PBS缓冲液溶解，然后在2~6℃、1~5倍重量的蒸馏水中透析8~16小时，反复3~5次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞（Pholiota nameko）蛋白粗粉；