[发明专利]用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌

说明书

技术领域

本发明涉及用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的医药中间体，用于生产β-内酰胺类半合成抗生素。β-内酰胺类半合成抗生素包括羟氨苄青霉素（阿莫西林）、头孢羟氨苄（欧意）等。与传统的青霉素G类抗生素相比，β-内酰胺类半合成抗生素具有抗菌谱广、毒性低、口服效果好等优点，临床应用广泛，市场非常巨大。据统计，2009年全球抗生素药物市场销售额为280亿美元，其中β-内酰胺类半合成抗生素约占65%，为182亿美元。从2000到2009年，仅阿莫西林和头孢羟氨苄产量就分别增长了614%和762%。这些药物的大规模生产使得D-对羟基苯甘氨酸的需求大幅增加。据悉，目前全球D-对羟基苯甘氨酸的需求量近3万吨，国内也接近2万吨。数据显示，每年全球D-对羟基苯甘氨酸的供应缺口约为6000吨，国内约3000吨，且供需矛盾随着需求量的逐年增加而越发严重。因此，开发高效的D-对羟基苯甘氨酸的生产方法非常重要。

目前，D-对羟基苯甘氨酸的生产方法主要有化学法和生物法。

化学法通过先合成DL-对羟基苯甘氨酸，然后再拆分得到D-对羟基苯甘氨酸。合成DL-对羟基苯甘氨酸主要有苯甲醛法和乙醛酸法。苯甲醛法通过使用对羟基苯甲醛与氰化钠作用生成对羟基-α-羟基苯乙腈，然后酸水解生成DL-对羟基苯甘氨酸，该法原料价格较高，且使用剧毒的氰化物，生产中存在HCN气体及含CN-废水的处理问题。乙醛酸法通过使用乙醛酸、苯酚等生成DL-对羟基苯甘氨酸，反应过程中需要大量酸碱，且需要高压。将DL-对羟基苯甘氨酸拆分成D-对羟基苯甘氨酸的常用方法有化学拆分法和诱导结晶法。化学拆分法是先将DL-对羟基苯甘氨酸在甲醇中以硫酸为催化剂制成甲醛，加入拆分剂制成DL-对羟基苯甘氨酸甲酯，再将其与拆分试剂作用生成盐，利用盐的溶解度不同分离。该法反应周期长，单程转化率低。诱导结晶法是将DL-对羟基苯海因与拆分剂在含有水醇溶液中加热制成饱和溶液，然后通过降温分离，操作繁琐，且产物不纯。综上所述，化学法在生产D-对羟基苯甘氨酸方面存在步骤繁琐、副反应多、收率较低的问题，给后续产物纯化带来困难。另外，化学法生产普遍需要高温高压，且经常使用大量酸碱，对环境污染较为严重。

生物法是以DL-对羟基苯海因作为底物，利用微生物中特定的酶或者利用其完整细胞将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。单酶法主要是通过表达海因酶将DL-对羟基苯海因转变成N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸，然后再经过化学法水解获得D-对羟基苯甘氨酸。由于D-海因酶可以特异性地生产D-对羟基苯甘氨酸，因此该法专一性强，收率较高，但缺点是反应过程仍然需要添加大量酸，对后续处理带来问题。

发明内容

本发明的目的是提供用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。

本发明提供的DNA分子，包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因，由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达；

所述D-海因酶是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将DL-对羟基苯海因转化为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的功能的由序列1衍生的蛋白质；

所述述N-氨甲酰水解酶是如下（c）或（d）：

（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白质。

所述PL启动子为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列5所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

所述D-海因酶基因为如下4）或5）或6）的DNA分子：

4）编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

5）在严格条件下与4）限定的DNA序列杂交且编码所述D-海因酶的DNA分子；

6）与4）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述D-海因酶的DNA分子；