[发明专利]显示CD44表面表达的细胞的细胞毒性介导

说明书

本申请是国际申请号“PCT/CA2007/000281”，国际申请日为2007年2月23日，进入中国国家阶段日期为2008年10月28日，中国国家申请号为200780015423.9的发明名称为“显示CD44表面表达的细胞的细胞毒性介导”的分案申请。

发明领域

本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，具体涉及肿瘤细胞的细胞毒性的介导；最具体地涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)作为起始细胞毒性反应的手段的用途，所述CDMAB任选地与一种或者多种化疗剂联用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。

发明背景

癌症中的CD44：抗人白细胞的单克隆抗体的培养导致了CD44抗原的发现；单链透明质酸(HA)结合糖蛋白在广泛的正常组织和所有类型的造血细胞上表达。其起初与淋巴细胞的激活和归巢相联系。当前，其推定的生理学作用还包括炎症基因的激活、细胞周期的调节、细胞增殖的诱导、分化和发育的诱导、细胞骨架重组的诱导和细胞迁移以及细胞存活/抵抗凋亡。

在人体中，CD44的单基因拷贝位于染色体11的短臂，11p13上。该基因包含19个外显子；前5个是恒定的，接下来的9个是可变的，随后的3个是恒定的，最后的2个是可变的。差异剪接可以造成超过1000种不同的亚型。然而，目前仅已鉴定出几十种天然存在的变体。

CD44标准糖蛋白由N-末端胞外(包括20个氨基酸的前导序列和近膜区(85个氨基酸))结构域(270个氨基酸)、跨膜区(21个氨基酸)和胞质尾巴(72个氨基酸)组成。胞外区还包含位于N-末端的连接模块。该区域有92个氨基酸的长度且显示出与其它HA结合连接蛋白的同源性。在鼠型和人型CD44之间存在很高的同源性。该蛋白的变体形式被插入外显子5的羧基末端且在表达时位于胞外。

CD44的血清可溶形式也是天然存在的，且能够通过终止密码子(在可变区内)或蛋白水解活性产生。通过各种刺激包括TNF-α对细胞的激活造成CD44受体的脱落。在肿瘤细胞中也观察到受体的脱落，且该脱落可导致CD44在人血清中的浓度增加多达10倍。CD44的高血清浓度暗示着恶性肿瘤(卵巢癌除外)。

CD44的标准形式以大约37kD的分子量存在。翻译后修饰将分子量增加至80-90kD。这些修饰包括氨基末端胞外结构域在天冬氨酸残基上的N-连接糖基化、在胞外结构域的羧基末端的丝氨酸/苏氨酸残基上的O-连接糖基化以及添加的粘多糖。剪接变体的大小可以为80-250kD。

HA，一种位于哺乳动物胞外基质(ECM)中的聚糖，被认为是主要的CD44配体。然而，也已经发现CD44与诸如胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等蛋白结合。HA结合和糖基化之间看起来存在关联。无活性的CD44(不结合HA)具有最高的糖基化水平，有活性的CD44(结合HA)糖基化水平最低而可诱导的CD44(除非被细胞因子、单克隆抗体、生长因子等激活，否则不与HA结合或很微弱地与HA结合)的糖基化水平在活性和无活性形式之间。

CD44通过信号转导通路能够介导其的一些功能，这些通路依赖于细胞的相互作用、刺激以及环境。这样的一些通路包括NFκB信号级联(涉及炎症反应)、Ras-MAPK信号转导通路(涉及细胞周期和增殖的激活)、Rho蛋白家族(涉及细胞骨架重组和细胞迁移)以及PI3-K相关信号通路(涉及细胞存活)。上述所有的功能与肿瘤疾病的发生和发展密切相关。CD44也被暗示通过各种额外的机理在癌症中发生作用。这些机理包括CD44细胞表面的细胞表面蛋白聚糖将生长因子、趋化因子和细胞因子呈递给涉及恶性肿瘤的受体。同样的，在CD44-HA复合物内化后由溶酶体透明质酸酶进行的HA的胞内降解也潜在地增加了肿瘤入侵和通过ECM诱导血管生成的可能性。此外，已经显示存活或凋亡信号的传递通过标准或可变CD44受体发生。CD44也被暗示涉及细胞分化和迁移。这些机理中的很多但非全部是环境和细胞依赖性的且一些机理产生了不同的发现。因此，在得出任何结论之前需要更多的研究。

为了证实CD44在癌症中潜在的功能作用，进行了CD44的表达研究以确定受体的差异性表达是否与疾病的进程相关。然而，在大部分的肿瘤类型中观察到不一致的现象，且这可能是由于研究人员之间在试剂的组和、技术、病理学评分和细胞类型上的差异造成的。肾细胞癌和非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤看起来是例外，因为具有高CD44表达肿瘤的患者始终比那些低CD44表达或无CD44表达的对应患者存活时间短。