[发明专利]一种通用型RNA干扰载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种RNA干扰载体及其构建方法和应用，特别涉及一种通用型的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

在动物中，RNAi可以通过U6启动表达shRNA来实现。目前的U6载体可以通过2种方式表达在动物细胞内表达：瞬时表达以及稳定表达。shRNA是由长度为50～70个核苷酸的单链分子产生的具有茎环结构的特殊小分子RNA。其结构特点是：5～10个核苷酸的环连接两条19～29个核苷酸的互补长链RNA片段，这两条片段通过碱基配对形成茎环结构。shRNA可以通过化学合成和体外转录合成在体外产生，但最典型的方式是通过PolIII的启动子在体内表达产生。紧随19～29nt靶基因反向互补序列之后连上5～6个T作为RNA聚合酶的转录终止子。

发明内容

本发明是结合亚克隆技术与RNA干扰(RNAi)技术所发明的新型通用型RNAi载体。为了使hU6启动子的使用更加方便，并且提高oligoDNA的连接效率。本发明通过改造hU6启动子的3‘端的核苷酸序列，产生可用的限制性酶切位点粘性末端。并且在载体上设计可以作为部分转录终止子可用碱基的酶切位点序列。本实验成功改造hU6启动子序列，所表达的shRNA无多余核糖核苷酸，成功抑制目标基因的表达；改造后的U6启动子结合亚克隆技术、转录终止子，使得U6启动子的使用更加方便、节约了时间，降低了成本，可以提高RNA干扰技术在一般实验室的普及应用。

为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种通用型RNA干扰载体，从5’端开始，包括以下依次相连的各部分：含有PCMV启动子的绿色荧光蛋白、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点。

其中多克隆酶切位点用于线性化质粒，暴露用于连接oligoDNA的粘性末端；人U6启动子以及终止子用于表达目的shRNA；绿色荧光蛋白用于观测质粒转染效率；PCMV-NEO：用于筛选具有稳定RNAi作用的单克隆细胞；复制起始位点(Origin)提供载体在大肠杆菌中的复制信息；AmP Promoter-AmP用于筛选阳性克隆或者是菌体的大量增殖。

在本发明中，优选的，所述的U6启动子序列是以质粒iαv-PENTR/U6为模板，通过使用以下引物扩增得到的：

F：5’-ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’

R：5’-CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3’；

所述的多克隆酶切位点与终止子序列是自行设计合成的核苷酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，优选的，所述的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提供了一种构建以上任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)突变型人U6启动子的构建

以含人U6启动子的载体为模板，使用点突变后的引物PCR扩增得到突变型人U6启动子，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-U6。扩增引物为：

F：5’-ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’

R：5’-CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3’；

(2)绿色荧光蛋白(GFP)的构建

以含可以完整表达绿色荧光蛋白元件的载体为模板，扩增得到含有PCMV、GFP、SV40POLY(A)的表达元件，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-GFP。扩增引物为：

F：5’-TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’

R：5’-TAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’；

(3)正筛选基因的构建

新霉素抗性基因NEO以及PCMV启动子以载体PGT-V1为模板进行克降，NEO的扩增引物为：