[发明专利]一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种产青蒿酸基因工程菌的构建方法。 

背景技术

青蒿素（artemisinin）是中国科学家于20世纪70年代从传统中草药青蒿或称黄花蒿（Artemisia annuaL.）中分离提纯的抗疟有效单体,其化学本质是含有“过氧桥”结构（1,2,4-三噁烷环）的倍半萜内酯。以青蒿素为母核经人工半合成获得的青蒿素琥珀酸酯（青蒿琥酯）、青蒿素甲醚（蒿甲醚）、青蒿素乙醚（蒿乙醚）和双氢青蒿素等青蒿素类药物，血中溶解性好，生物利用度高，对氯喹抗性疟疾及致命性脑型疟有特效，已成为世界卫生组织（WHO）倡导的“基于青蒿素的联合疗法”（artemisinin-based combination therapies,ACTs）首选的抗疟新药，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚复方已被列入WHO“基本药品目录”。 

目前而言青蒿素的来源主要有4种方式： 

第一种是直接从青蒿中提取，这是目前青蒿素的主要来源。但是青蒿的分布地域狭窄，青蒿中青蒿素的含量很低，因此天然来源的青蒿素已不能满足日益增长的需要。 

第二种方式是通过化学全合成来生产青蒿素，这种方式成本高，难度大，目前还不能投入生产，基本上处于试验阶段。 

第三种方式是通过细胞培养来生产青蒿素，研究报道，实验室培养的青蒿发状根中青蒿素的含量能达550mg/L，但要进行商业化生产还有很多工作要做。 

第四种方式是通过代谢工程来生产青蒿素，在模式菌构建青蒿酸生物合成途径，利用重组的模式菌生产青蒿酸，再以青蒿酸为原料化学合成青蒿素。 

经过多年研究，青蒿素的生物合成基本已经阐明，主要包括三个阶段：第一步是乙酰辅酶A形成法尼基焦磷酸（FPP）；第二步是通过FPP合成倍半萜紫穗槐-4,11-二烯；最后一步是由紫穗槐-4,11-二烯合成青蒿酸或二氢青蒿酸。进而形成青蒿素（图1）。 

2003年，Martin等在大肠杆菌中导入9个基因，这9个基因包括合成MVA（甲羟戊酸）的编码基因以及ADS（紫穗槐-4,11-二烯合酶）基因，通过在大肠杆菌中重建MVA途径和紫穗槐-4,11-二烯合成途径，使其产生了青篙素关键中间产物紫穗槐-4,11-二烯（Martin VJ,Pitera DJ,Withers ST,et al.Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.Nat Biotechnol,2003,21:796-803）。 

2006年，Lindahl等在酿酒酵母中导入含ADS基因的质粒或将ADS基因整合到酵母染色体上，分别获得600和100μg/L紫穗槐-4,11-二烯。这是第一次在真核生物中生产出青篙素体，为今后利用酵母生产青篙素前体提供了可能（Lindahl Ann-Louise,Olsson M E.,Merche P,et al,Production of the artemisinin preceursor amorpha-4,11-diene by engineered Saccharomyces cerevisiae,Biotechnology Letter,2006,28:571-580）。 

同年，Ro DK等以酿酒酵母为宿主菌，导入ADS、CYP71AV1基因，重建了青篙酸的代谢途径，并通过培养条件优化，获得115mg/L青蒿酸（Ro DK,Paradise EM.,Ouellet M et al,Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineerd yeast,Nature,2006,440:940-943）。 

2007年，专利申请CN200710187922.8公开了导入HMG-CoA、ADS合酶和FPP合酶以及其他基因的方法构建青蒿酸生产菌。 

根据上述文献，虽然可以构建出青蒿酸基因工程菌，但是构建时需要依次将青蒿酸表达相关的基因整合于酵母菌染色体上，涉及多级克隆，且依赖于合适的酶切位点选择，操作繁琐，周期长。 

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明旨在提供一种产青蒿酸基因工程菌的 构建方法。