[发明专利]水稻抗瘟基因Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,其特征在于，为以水稻品种抗源品种28占（EBZ）总DNA为模板，通过下列碱基序列的引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTGAATGTAATTAGATCTGCC

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTACCCCACAATTACAATCAG

所得PCR产物经限制性内切酶Xba I酶切后，与Pi50呈特异性带型分子标记。

2.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,其特征在于，所述稻瘟病抗性基因Pi50包括7个编码NBS-LRR类蛋白的基因，其中，基因特异性分子标记Pi50N4s位于第4个NBS-LRR类蛋白基因中。

3.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s,所述稻瘟病抗性基因Pi50为通过图位克隆方法（Map-based cloning）从水稻品种抗源品种28占（EBZ）中分离鉴定得到。

4.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1）利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pi2/Pi9BAC以及Pi50区域95kb序列，比较Pi50对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pi50中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基（SNP）差异位点，得知该SNP位于候选基因Pi50-Nbs4中；

步骤2）根据dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences;Neff et al.,2002.Trends in Gene tics18:613-615)标记的开发原理，利用步骤1）获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTGAATGTAATTAGATCTGCC

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTACCCCACAATTACAATCAG

利用上述引物对，以水稻品种抗源品种28占（EBZ）总DNA为模板，进行PCR扩增，得到可进行电泳检测的DNA片段，即为所述稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s。

5.如权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s的制备方法，其特征在于，还包括步骤3），利用步骤2）所述的引物对，对多个不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，获得Pi2/9基因簇多个抗源品种对应于Pi50特异SNP位点的片段，与步骤2获得的DNA片段进行比较验证，从而确定Pi50基因特异性的分子标记Pi50N4s。

6.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

7.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记Pi50N4s在鉴别普栽水稻品种中稻瘟病抗性基因的应用。