[发明专利]通过聚乙二醇的介导将致诱变核碱基引入植物原生质体的改进的诱变方法

说明书

本申请是申请号为200780101787.9，申请日为2007年12月21日，发明名称为“通过聚乙二醇的介导将致诱变核碱基引入植物原生质体的改进的诱变方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及通过将单链DNA寡核苷酸致诱变核碱基引入细胞而在靶细胞中的DNA特定位点上特异性和选择性改变核苷酸序列的方法。更特别地，本发明涉及通过使用聚乙二醇（PEG）将致诱变核碱基引入植物原生质体的定向诱变的方法。本发明进一步涉及含有致诱变核碱基和PEG的试剂盒。本发明还涉及PEG用于增强定向诱变的用途。

背景技术

有意地在活细胞的遗传物质中产生改变的过程具有修饰所述细胞或生物体（所述细胞形成该生物体的一部分或能够再生形成该生物体）的一个或多个遗传编码的生物学特征的目的。这些改变可以采取下列形式：删除部分遗传物质、添加外源性遗传物质或改变遗传物质的已有核苷酸序列。人们知道改变真核生物遗传物质的方法已经有20多年，所述方法在植物、人和动物细胞和微生物中有广泛的应用，用于农业、人类健康、食品质量和环境保护领域中的改进。最常见的方法由向细胞的基因组中加入外源性DNA片段组成，这将赋予所述细胞或其生物体优于或超过已有基因所编码的性质的新性质（包括其中已有基因的表达将因此被抑制的应用）。虽然许多这样的例子在获得所需性质中是有效的，然而这些方法不是十分精确，因为对外源性DNA片段插入至基因组的位置没有控制（因而对最终的表达水平没有控制），并且因为所需的效果必须通过优于原始的和平衡良好的基因组所编码的天然性质表现出来。相反，引起预先确定的基因组位点中的核苷酸的添加、删除或转换的定向诱变的方法将允许精确地修饰已有的基因。另外，由于定向诱变的精确特性，可以预料的是以此方式获得的新型植物系将更易于被消费者接受。

定向诱变是一种定点诱变的方法，其基于将合成的致诱变核碱基（由以其Watson-Crick碱基配对性质与DNA相似但在化学上可以不同于DNA的短串核苷酸样部分（moietie）组成）递送进入真核细胞核(Alexeev和Yoon Nature Biotechnol16:13431998;Rice Nature Biotechnol.19:321,2001;Kmiec,J.Clin.Invest.112:632,2003)。一旦被引入细胞，这样的致诱变核碱基在靶位点上与互补序列碱基配对。通过有意地在核碱基中设计错配，该错配可以在靶基因组序列中的相应位置上引起核苷酸转换。该方法允许在内源性位点上转换单个核苷酸或最多几个核苷酸，但是可以应用于在已有位点上产生终止密码子，从而引起其功能的破坏，或产生密码子改变，从而产生编码具有改变的氨基酸组成的蛋白的基因（蛋白工程）。

在植物、动物和酵母细胞中已经描述了定向诱变。两类不同的合成性致诱变核碱基已经用于这些研究：嵌合的DNA:RNA核碱基或单链核碱基。