[发明专利]通过聚乙二醇的介导将致诱变核碱基引入植物原生质体的改进的诱变方法

权利要求书

1.一种在植物细胞原生质体中定向改变双链受体DNA序列的方法，其包括将双链受体DNA序列与供体致诱变核碱基结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列并且其中供体致诱变核碱基相对于要改变的双链受体DNA序列，优选相对于第一DNA序列包含至少一个错配，其中该方法进一步包括使用聚乙二醇（PEG）介导的转化将致诱变核碱基引入细胞原生质体中的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中致诱变核碱基是单链致诱变核碱基。

3.根据权利要求2所述的方法，其中单链致诱变核碱基的长度介于10-60个核苷酸之间。

4.根据权利要求1到3所述的方法，其中致诱变核碱基含有与错配距离至少一个核苷酸的，并且，可选地，与致诱变核碱基的5’和3’末端距离至少3、4或5个核苷酸的锁定的核酸（LNA）置换。

5.根据权利要求4所述的方法，其中单链致诱变核碱基含有位于与错配的任一侧距离至少一个核苷酸的两个LNA。

6.根据权利要求1-4所述的方法，其中致诱变核碱基含有丙炔置换。

7.根据权利要求2-6所述的方法，其中单链致诱变核碱基与核定位信号结合。

8.根据任意前述权利要求所述的方法，其中受体DNA来自基因组DNA、线性DNA、哺乳动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA或游离型DNA。

9.根据任意前述权利要求所述的方法，其用于改变细胞、通过恢复至野生型改正突变、诱导突变、通过打乱编码区而使酶失活、通过改变编码区而修饰酶的生物活性或通过打乱编码区而修饰蛋白。

10.PEG介导的转化用于增加植物原生质体中使用致诱变核碱基的定向诱变的效率相对于基于电穿孔的转化的效率至少10倍的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中致诱变核碱基是单链致诱变核碱基，优选地，其中单链致诱变核碱基的长度介于10-60个核苷酸之间。

12.根据权利要求10-11所述的用途，其中致诱变核碱基含有与定向错配距离至少一个核苷酸的，并且，可选地，与致诱变核苷酸的5’和3’末端距离至少3、4或5个核苷酸的LNA置换。

13.根据权利要求12所述的用途，其中单链致诱变核碱基含有位于与错配的任一侧距离至少一个核苷酸的两个LNA。

14.根据权利要求10-12所述的用途，其中致诱变核碱基含有丙炔置换。

15.根据任意前述权利要求所述的用途，其中受体DNA来自基因组DNA、线性DNA、哺乳动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA或游离型DNA。

16.根据任意前述权利要求所述的用途，用于改变细胞、通过恢复至野生型改正突变、诱导突变、通过打乱编码区而使酶失活、通过改变编码区而修饰酶的生物活性或通过打乱编码区而修饰蛋白。

17.利用根据权利要求1-9任一项所述的方法或利用根据权利要求10-16任一项所述的用途获得的植物、植物细胞、植物细胞原生质体、植物愈伤组织或芽。