[发明专利]25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及临床体外诊断及医学免疫学领域；具体地涉及一种免疫检测试剂；更进一步地，本发明涉及一种25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

维生素D也称抗佝偻病维生素，又可分为维生素D2和维生素D3。维生素D2多含于植物性食物中，它是由植物的麦角固醇经阳光照射而合成的，维生素D3可由人体皮肤和脂肪组织在7-脱氢胆固醇经过阳光照射合成。维生素D2属脂溶性维生素，来自食物中的维生素D与脂肪一起经小肠吸收，在胆汁协助下形成乳糜微粒，由淋巴管进入血液，与自身合成的维生素D3一起转运入肝脏。在肝脏中经肝细胞微粒体中的单氧酶系统（25-羟化酶）的作用，形成25羟维生素D。25羟维生素D在肾近端小管上皮细胞线粒体内α羟化酶系统的作用下转变为1,25(OH)₂D3，它是维生素D最大的生物作用形式，可以促进肠道钙结合蛋白的合成。而25羟维生素D是代谢中的主要循环形式，能够反映机体的维生素D水平。

维生素D缺乏又称维生素D缺乏性佝偻病。常见于婴幼儿，多见于膳食中缺乏维生素D，或者是人体缺乏阳光的照射。由于体内维生素D不足而引起钙、磷代谢障碍，钙盐不能正常地沉积于骨骼的生长部分，以致出现生长骨发生病变为特征的一种慢性营养性疾病，称为佝偻病。如果该病发生于成人，则出现发育成熟骨骼的钙化不全，称为骨软化症。研究还表明，维生素D缺乏可能使某些癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发病风险升高。

根据当前糖尿病报告杂志上发表的结果，3,262例年龄50-70岁之间的中国人参加的一项研究表明94％的人维生素D缺乏或不足，这些人中有42％还有代谢综合征。其它一些研究表明，维生素D缺乏和不足在中国的孕妇以及6-16岁的儿童中也很常见。而长期摄入过多的维生素D（5000IU），将引起高血钙和高尿钙。特征为食欲减退，过度口渴、恶心、呕吐、烦躁、体弱、便泌腹泻交替出现，严重者将因肾钙化、心脏和大动脉钙化而死亡。随着医疗专业人员和患者意识到维生素D缺乏的潜在健康风险，实验室检验量激增，需要我们提供更快、更准、更有效的检测方法，帮助医生和患者更早的得到检测结果。

目前25羟维生素D的测定方法主要有酶联免疫法（如CN102628872A中公开的方法和试剂盒，以及DRG提供的25-OH维他命D（总）检测试剂盒EIA5396）、放射免疫法（如Hollis BW等人，1985）、液相色谱-质谱检测法（如郑晓艳等人，2012）以及化学发光法（如单咏梅等人，2011；索灵生产的25-羟基总维生素D定量测定试剂盒（化学发光法））。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题；液相色谱质谱操作复杂，用时较长；而化学发光法灵敏度虽高，但检测成本较高，需要特定化学发光仪，这些原因导致其应用范围较小。

本发明采用胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度，该方法对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。而目前市场上还未出现胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度的试剂盒，与其它测定方法比较，本方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围和实用价值。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种25羟维生素D检测试剂盒，其包含第一试剂，和第二试剂。第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液，第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种；缓冲液浓度为10-500mM。

在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型可以相同也可以不同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。

在一些优选实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。

在一个具体实施方式中，第一试剂的缓冲液是50mM MES缓冲液；第二试剂的缓冲液是20mM MES缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度等因素的改变，缓冲液的pH值可以有所不同。

在一些实施方式中，25羟维生素D抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；维生素D结合蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠或兔。

在一些实施方式中，所述25羟维生素D抗原为自然抗原或人工合成抗原。