[发明专利]一种植物内生菌的分离方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，进一步属于微生物技术领域，具体涉及一种植物内生菌的分离方法。    

背景技术

植物内生菌是指生活在健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，在其生活过程中宿主植物不表现出外在的病症，植物与其内生菌属于互惠共生的关系。植物为内生菌提供光合产物和矿物质，而内生菌的代谢产物则能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。由于将植物内生菌作为生防因子具有独特的优势：它们分布于植物的不同组织中，受到植物组织的保护，具有稳定的生态环境，与附生菌相比更易于发挥生防作用，因此，有关植物内生菌的研究正成为国内外环境、生物、化学等领域的焦点。 

植物内生菌普遍存在于植物体的各个部位且种类繁多，而人们对这些内生菌的栖息部位和种类多样性仍然知之甚少。因而，为了充分开发利用植物内生菌及其代谢产物资源，首先必须实现植物内生菌的完全、准确的分离。目前常用的分离方法均采用化学消毒剂对植物表面进行消毒处理，分离获取植物细胞内或细胞间的内生菌。但在实际操作中，每个处理步骤的时间界定往往采取的是经验值，并未充分考虑到不同植物或植物的不同组织，在不同的生育期因其结构或生理特性的不同而造成的处理效果特异性。因而，常常导致所分离获取的植物内生菌种类和数量降低。 

此外，植物材料表面消毒后，从植物体内分离获取内生菌的方法或者是剖开植物材料从中切取组织薄片，或者是用移液管刺入有汁液的果实内部吸取汁液。这些方法尽管简便易行，减少了污染，却也使得分离获取的内生菌的数量和种类非常有限。这是由于内生菌在植物体内分布的不均匀性，导致分离的结果不能充分地代表整个植物体内生菌的数量和种类。因此，为了充分开发植物内生菌的基因资源及其代谢产物的利用潜能，首先，必须找到一种能够完全且准确的分离植物内生菌的方法；然后，在分离的基础上进一步对植物内生菌做深入的多样性分析，为后续的产业化利用及推广打下坚实的基础。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物内生菌的分离方法。 

本发明的目的是这样实现的，包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯培养步骤，具体包括： 

A、采样：选择生长性状良好、无病害症状的健康植株进行采样，将得到的植物材料按不同植物及组织类别分类保藏；

B、表面灭菌：将采集的植物材料在65~75%的乙醇溶液中浸泡30~90s后，再在有效氯含量0.5~1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡40~320s，用无菌水冲洗3~5次；

C、组织研磨：称取0.3~0.5g经预处理后的植物材料，与灭菌研磨珠一并置于离心管中，加入500~700μl无菌水，研磨120~240s，频率为20~40r/s；

D、分离及纯培养：研磨后的浆液梯度稀释10~10⁴倍，各取200μl稀释液涂布后在25~32℃下平板培养24~48h，每样品重复3~5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存。

本发明所述的植物材料表面消毒法综合考虑了植物不同组织的吸附特性和消毒剂的渗透特点，准确的界定了不同植物组织的灭菌时间，能够彻底杀灭植物材料表面的各种微生物，最大限度的保证了植物内生菌调查的准确性；采用高通量组织研磨机进行植物材料的破碎，提高了工作效率，更能使植物内生菌充分释放。此内生菌分离方法有效避免了人为扩大或丢失植物内生菌的分离获得，为研究植物内生菌的种群组成特征，丰富内生菌资源具有十分重要的作用。 

附图说明

图1为本发明工艺流程图。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。 

本发明所述的植物内生菌的分离方法，包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯培养步骤，具体包括： 

A、采样：选择生长性状良好、无病害症状的健康植株进行采样，将得到的植物材料按不同植物及组织类别分类保藏；

B、表面灭菌：将采集的植物材料在65~75%的乙醇溶液中浸泡30~90s后，再在有效氯含量0.5~1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡40~320s，用无菌水冲洗3~5次；

C、组织研磨：称取0.3~0.5g经预处理后的植物材料，与灭菌研磨珠一并置于离心管中，加入500~700μl无菌水，研磨120~240s，频率为20~40r/s；