[发明专利]一种植物内生菌的分离方法

权利要求书

1.一种植物内生菌的分离方法，其特征在于包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯培养步骤，具体包括：

A、采样：选择生长性状良好、无病害症状的健康植株进行采样，将得到的植物材料按不同植物及组织类别分类保藏；

B、表面灭菌：将采集的植物材料在65~75%的乙醇溶液中浸泡30~90s后，再在有效氯含量0.5~1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡40~320s，用无菌水冲洗3~5次；

C、组织研磨：称取0.3~0.5g经预处理后的植物材料，与灭菌研磨珠一并置于离心管中，加入500~700μl无菌水，研磨120~240s，频率为20~40r/s；

D、分离及纯培养：研磨后的浆液梯度稀释10~10⁴倍，各取200μl稀释液涂布后在25~32℃下平板培养24~48h，每样品重复3~5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存。

2.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于A步骤所述的保藏为密封0~4℃低温保藏。

3.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于A步骤所述的保藏时间为8~24h。

4.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的植物材料为植物的根、茎、叶。

5.根据权利要求4所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的植物材料为植物的根、茎、叶在1%的次氯酸钠溶液中的浸泡时间分别为290~310s、170~190s、50~70s。

6.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的预处理后还需检验灭菌效果。

7.根据权利要求6所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的检验灭菌效果是将最后一次的冲洗水涂布NA平板，28℃培养48h后记录菌落数，计算表面除菌率以检验灭菌效果，每处理重复3次。

8.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的研磨珠由直径不同的钢珠配合构成。

9.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的研磨采用高通量组织研磨器完成。

10.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于D步骤所述的菌落表型特征为菌落的形状、大小、干湿、颜色、质地、表面、边缘及透明度。