[发明专利]表达重组人FVIII的整合质粒、细胞株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，包括：

rAAV质粒骨架，以及，

整合于所述rAAV质粒骨架中的B区缺失的FVIII基因。

2.根据权利要求1所述的表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，所述B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间。

3.根据权利要求2所述的表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，所述整合质粒中还包含用作后续细胞株的筛选标记的GFP基因和/或用以提高整合效率的AAV p5 启动子。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5GDNFGFP经NheI和NsiI双酶切去除GDNF基因后所形成的rAAV质粒骨架。

5.一种表达重组人凝血因子的整合质粒的构建方法，其特征在于，包括：

提供rAAV质粒骨架，并将B区缺失的FVIII基因连接至rAAV质粒骨架中，获得目标产物。

6.根据权利要求5所述的表达重组人凝血因子的整合质粒的构建方法，其特征在于，包括：将B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间；

所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5GDNFGFP经NheI和NsiI双酶切去除GDNF基因后所形成的rAAV质粒骨架。

7.一种表达重组人凝血因子的细胞株，其特征在于，包括经过权利要求1-4中任一项所述的整合质粒或权利要求5-6中任一项所述方法构建的整合质粒以及用于表达AAV Rep蛋白的质粒共转染的，且能稳定表达BDD-FVIII的HEK 293细胞。

8.根据权利要求7所述的表达重组人凝血因子的细胞株，其特征在于，所述用于表达AAV Rep蛋白的质粒包括pSVAV2质粒。

9.一种重组人凝血因子的生产方法，其特征在于，包括：

培养权利要求7-8中任一项所述的细胞株，而后收集培养产物，获得目标产物。

10.根据权利要求9所述的重组人凝血因子的生产方法，其特征在于，包括：

将权利要求7-8中任一项所述的细胞株置于适合培养HEK 293细胞的环境中，使所述细胞株长至80～90%，而后将所述细胞株无血清培养24h以上，收集培养上清，获得目标产物。