[发明专利]调控基因对核苷类抗生素生物合成的调节作用

说明书

发明领域

本发明涉及链霉菌Streptomyces sp.SS中sansanmycin的生物合成基因簇中的调节基因ssaA的正调控功能及其对sansanmycin的生物合成的负反馈调控模式。本发明还涉及通过提高基因拷贝数和利用组成型表达的强启动子对正调节基因进行过表达以提高sansanmycin产量的方法。本发明还涉及通过降低发酵液中sansanmycin浓度来去除负反馈抑制以提高sansanmycin产量的方法。

背景技术：

sansanmycin是由我国贵州土壤中发现的链霉菌Streptomyces sp.SS(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心菌种保藏号为CGMCC No.1764)所产生的一组尿苷肽类抗生素，此类抗生素家族还包括pacidamycins，napsamycins and mureidomycins等(如图1)。sansanmycin对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，结合分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv及多重耐药结核分支杆菌具有很好的抑制作用。尿苷肽类抗生素作用机理新颖，通过抑制细胞壁合成过程中的关键酶UDP-N-乙酰胞壁酸-五肽转位酶而抑制细胞壁合成。目前，临床上还没有在用的UDP-N-乙酰胞壁酸-五肽转位酶抑制剂，与现用的抗生素不会产生交叉耐药，因此尿苷肽类化合物有可能是寻找新型低毒、窄谱抗菌药物的先导化合物或候选药物的最佳选择之一。

链霉菌能产生大量具有药用价值的次级代谢产物，包括临床用抗生素、抗癌药物及免疫抑制剂等。链霉菌次级代谢产物的调控是一个涉及多级水平调控的复杂过程。一般来说，处于这个多水平调控网络最后一级的是位于抗生素基因簇内的途径特异性调节基因，控制着相应的抗生素的产生。大部分的途径特异性转录调控因子是属于链霉菌抗生素调控蛋白家族(Streptomyces antibiotic regulatory protein，SARP)，此类蛋白N-端含有一个DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)，C-端含有一个细菌转录激活结构域(bacterial transcriptionalactivation domain，BTAD)，如控制放线紫红素产量的ActII-ORF4。链霉菌LAL转录因子家族(large ATP-binding members of the LuxR family，LAL)也常存在于一些抗生素的基因簇内，如pikromycin基因簇中的PikD。此外，其他类型的转录调控因子最近也有陆续报道，如多烯大环内酯类抗生素pimaricin生物合成的转录激活子PimM是由N-端的PAS感应结构域和C-端的DNA结合结构域构成的；非典型的反应调节因子(Atypical response regulators，ARRs)的N-端是一个REC结构域(Receiver Domain)，C-端是一个DNA结合结构域。抗生素调控因子的多样性，暗示着其调控机制的多样性。研究表明，jadomycin的途径特异性转录激活因子JadR(ARRs家族成员)，其DNA结合活性受到终产物jadomycins的负反馈调控，从而实现对jadomycin生物合成的精细调控。十一烷基灵菌红素的途径特异性转录激活因子RedZ，auricin的途径特异性转录激活因子Aur1P也存在类似的调控模式。以上研究报道表明，对于ARRs来说，其活性受到途径特异性产物的反馈调节也许是一种普遍存在的现象。然而其他类型的转录调控因子是否也采取类似的调控机制还需要进一步的研究。

目前，pacidamycin和napsamycin的生物合成基因簇已经被成功克隆。基于生物信息学分析、体内外的生物学实验结果，pacidamycin的生物合成途径已经得到比较详细的解释。一般来说，在抗生素的生物合成基因簇中往往存在至少一个转录调节基因，控制该抗生素的生物合成，Zhang等通过BLSTP分析在pacidamycin生物合成基因簇中并没有发现转录调节基因：在Kaysser等报道的napsamycin生物合成基因簇中，npsA编码的蛋白与Streptomyceshygroscopicus中可能的ArsR家族转录抑制子Mpps蛋白具有42％的相似性，从而推测npsA可能为napsamycins的生物合成调节基因，但目前尚无利用生物学实验NpsA的功能进行验证的报道。