[发明专利]一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法

权利要求书

1.一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法，其特征在于：将发芽的蚕豆根尖悬浮于待监测的废水，切取根尖，置于蛋白酶K溶液，抽真空；分离细胞核，进行单细胞凝胶电泳，拍摄彗星细胞图片，测量彗星尾长和尾矩，进行显著性分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将待监测废水用自来水稀释成适宜浓度梯度的废水溶液，检测各剂量组根尖细胞核的DNA损伤水平。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中根尖置于100μg/mL蛋白酶K溶液中，抽真空。

4.根据权利要求1所述的方法，其步骤包括：

（1）蚕豆种子的催芽培养：蚕豆种子用0.1%次氯酸钠溶液消毒，充分清洗后于23-25℃和75%相对湿度环境下催芽，发芽后转移至石英砂中继续培养；

（2）待根尖长至2cm时，悬浮培养于适宜浓度梯度的废水稀释溶液，同时以自来水作为对照，培养条件同步骤（1）；

（3）培养2周后剪取1cm根尖；将暴露组和对照组根尖均置于100μg/mL蛋白酶K溶液，室温下抽真空；

（4）清洗根尖，液氮速冻，解冻后用玻璃棒末端轻轻碾压根尖，用核提取液提取细胞核，50μm尼龙膜过滤，1000×g低温离心8min，收集细胞核；

（5）单细胞凝胶电泳，溴化乙锭染色，荧光显微镜下观察和拍摄彗星细胞；

（6）测定彗星尾长和尾矩；

（7）显著性分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中抽真空条件为：0.09Mpa，3min/次，间歇3min，重复6次。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中核提取液为50mM Tris-HCl,10mM Na₂EDTA,100mM NaCl,0.1%TritonX-100,pH7.4。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）中单细胞凝胶电泳步骤为：在载玻片上制备含有一定数量细胞核的胶板，52°C孵育0.5h；胶板转移至水平电泳槽，在预冷的中性电泳液中浸没30min后，在0.42V.cm^-1和50mA条件下电泳35min；先用中和缓冲液浸没胶板15min，再用无水乙醇浸没胶板10min，最后应用0.1%（m/v）溴化乙锭染色5分钟；荧光显微镜下观察和拍摄彗星细胞。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤（6）中应用CometScoreimage-analysis system测定彗星尾长、尾矩，然后应用SPASS软件进行统计分析。