[发明专利]沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，以沙门氏菌效应蛋白SopB全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的从N末端第29位至第168位共计140个氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清；

步骤二，纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，克隆编码沙门氏菌效应蛋白SopB N末端第29位至168位共计140个氨基酸的蛋白的如SEQ ID NO:9所示的SopB29-168核酸片段；

步骤2，将步骤1得到的SopB29-168核酸片段和pSUMO表达载体分别酶切后构建第一连接体系，转化大肠杆菌，筛选pSUMO-SopB29-168重组质粒；利用所得的pSUMO-SopB29-168重组质粒转化大肠杆菌，培养，融合蛋白的诱导，裂解，挂镍柱，Ulp1酶切，纯化后，得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白；

步骤3，以步骤2所得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清，利用HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述克隆所用引物对具体为SEQ ID NO:10所示的上游引物和SEQ ID NO:11所示的下游引物。

4.根据权利要求3所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述构建的第一连接体系由1μl BamHl和XhoI酶切后的pSUMO表达载体、7.5μl BamHl和XhoI酶切后的所述SopB29-168核酸片段、1μl10×连接酶缓冲液和0.5μl T4DNA连接酶组成，连接条件是16℃连接过夜；所述筛选pSUMO-SopB29-168重组质粒的过程为：将所述第一连接体系转化至大肠杆菌DH5α中，使用含有34μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃下培养12-16h，随机挑取4个单克隆接种于5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜，提取质粒并用BamHl和XhoI双酶切鉴定，选取重组质粒测序，测序正确的即为所需的pSUMO-SopB29-168重组质粒。

5.根据权利要求4所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述培养的过程为：将所述pSUMO-SopB29-168重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，过夜培养后挑取单克隆至5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜；将所得过夜培养物接种至1L含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养2.5-3h，至大肠杆菌BL21(DE3)的OD₆₀₀值为0.6-0.8之间。

6.根据权利要求5所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述融合蛋白的诱导具体为：在上述OD₆₀₀值为0.6-0.8之间的大肠杆菌BL21(DE3)培养液中加入诱导剂异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷，使诱导剂的终浓度为0.1mmol/L，在22℃下振荡诱导培养12h。

7.根据权利要求6所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述裂解具体为：将上述1L诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养液离心收集菌体，用50ml第一裂解缓冲液重悬，所述第一裂解缓冲液的组成为50mmol/L Tris-HCl,内含500mmol/L氯化钠、20mmol/L咪唑、1mmol/L苯甲基磺酰氟和0.2μmol/L细菌蛋白酶抑制剂混合物cocktail3,pH值为8.0;将重悬后的菌液在0℃冰水浴中用功率为400w的超声波进行超声破碎，间歇破碎90次，每超声3秒，间隔7s；将超声波破碎后的菌液于13200转/分钟的转速下离心30min，收集上清液，所得上清液于0.45μm膜过滤后得到破碎的大肠杆菌上清液备用。