[发明专利]靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于基因重组及生物分子材料制备技术领域，涉及靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法。

背景技术

亲合体是通过定向分子进化技术筛选获得的一类新型的独特的蛋白结合配体，其作用类似于抗体，但却拥有比抗体更加优越的性质：亲合体的结合位点与抗体相似且亲和力强；分子量小，不易在体内诱发免疫应答，组织穿透性好；性质十分稳定，可人工合成。

亲合体的这些独特优势引起了科研工作者的关注，目前已发现的亲合体主要有Z_HER2和Z_EGFR两类。研究人员利用Z_HER2作为HER2高表达肿瘤疾病（宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等）的特定靶向配体，利用Z_EGFR亲和体作为EGFR高表达肿瘤疾病（皮肤癌等）的特定靶向配体，已展开了较多的研究，探索其各种潜在应用，包括肿瘤靶向成像和靶向治疗。有研究报道将Z_HER2:342亲合体与量子点或磁性氧化铁纳米颗粒连接，二者均在卵巢癌中实现了高的特定靶向能力。利用Z_EGFR：1907与⁶⁴Cu相偶联制成PET造影剂在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株中可实现很强的对比增强效果。以上研究结果表明这两种亲合体Z_HER2:342、Z_EGFR：1907可作为高亲和力的靶向分子与目标分子或探针连接，实现靶向功能化。

随着现代纳米生物医学技术的发展，基于纳米技术的靶向性输送体系有望实现传统肿瘤诊断和治疗方法所无法企及的高效、低毒的效果，成为肿瘤诊断和治疗的有效手段之一。靶向分子是构建靶向性输送体系的重要因素，亲合体的独特优势决定了其可作为高亲和力靶向分子连接到纳米载体上，实现主动靶向。

目前，将亲合体Z_HER2:342、Z_EGFR：1907作为靶向分子进行靶向肿瘤能力的研究中，亲合体主要是通过化学合成获得的（1.Orlova A,et al.Synthetic affibody molecules:A novel class of affinity ligands for molecular imaging of HER2-expressing malignant tumors.Cancer Research.2007;67:2178-2186；2.Gao JH,et al.Affibody-based nanoprobes for HER2-expressing cell and tumor imaging.Biomaterials.2011;32:2141-2148；3.Tolmachev V,et al. Tumor Targeting Using Affibody Molecules:Interplay of Affinity,Target Expression Level,and Binding Site Composition.Journal of Nuclear Medicine.2012;53:953-960；4.Miao Z,et al.Small-Animal PET Imaging of Human Epidermal Growth Factor Receptor Positive Tumor with a⁶⁴Cu Labeled Affibody Protein.Bioconjugate Chemistry.2010;21:947-954；5.Hoppmann S,et al.¹⁷⁷Lu–DO3A–HSA–Z_EGFR:1907:characterization as a potential radiopharmaceutical for radionuclide therapy of EGFR-expressing head and neck carcinomas.Journal of Biological Inorganic Chemistry.2012;17:709-718.）。但化学合成亲合体的方法成本较高，且杂质多，不易纯化。也有研究者通过构建表达载体在大肠杆菌中实现亲合体Z_HER2:342和Z_EGFR:1907的表达（6.Orlova A,et al.Tumor Imaging using a picomolar affinity HER2 binding affibody molecule.Cancer Research.2006;66:4339-4348；7.Gopal V,et al.Structure prediction and validation of an affibody engineered for cell-specific nucleic acid targeting.Systems and synthetic biology.2010;4:293-297；8.Govindarajan S,et al.Targeting human epidermal growth factor receptor 2 by a cell-penetrating peptide-affibody bioconjugate.Biomaterials.2012;33:2570-2582；9.Tolmachev V,et al.Affibody Molecules for Epidermal Growth Factor Receptor Targeting In Vivo:Aspects of Dimerization and Labeling Chemistry.Journal of Nuclear Medicine.2009;50:274-283.）。但由于其中亲合体的编码序列未经优化，产物表达量较低，且产物与目标分子或探针的连接位点较少，不易实现靶向功能化。