[发明专利]一种规模化生产转移因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及由动物脾脏提取转移因子的方法。

背景技术

Lawrence等于1953年首先发现白细胞的可透析物质具备活淋巴细胞的功能，并把引起这种效应的物质称之为“转移因子”。

转移因子是小分子肽类、核糖、氨基酸及未知因子的混合物,其成分多达200多种，分子量小于10000道尔顿，对紫外光有吸收特性，最大吸收波长为E230～280nm，平均值为E250nm，不耐热，56℃下30min即可灭活，但其活性不为胰蛋白酶、DNA酶和RNA酶破坏，冻融后稳定，在-20℃以下保存数年之久活性不消失。转移因子在人药和兽药方面应用广泛，临床主要用于调节机体免疫力及病毒性、细菌性疾病的治疗或辅助治疗。

目前转移因子制备技术方案主要有透析法、加热法、醇提取法、超滤法和基因工程法等。下面就上述方法中涉及的细胞破碎方法和转移因子提取或制备工艺描述如下：

第一阶段，脾脏细胞破碎方法：除基因工程法外，现有的技术方案大多采用动物脾脏为原料，匀浆，用生理盐水适当稀释，而后用超声波法、机械法、化学法或冻融法等进一步破碎脾脏细胞，使其内容物释放出来而后提取转移因子。脾脏细胞破碎方法具体来说主要有以下几种：

1.1超声波法：处理的脾脏细胞破碎率极高，据我们实验，将超声波破碎机功率设定为200W，将初步处理的脾脏细胞分为3组，第一组处理10分钟，第二组处理20分钟，第三组处理30分钟，其细胞破碎率分别为99.51%，99.90%和100%，但超声波在工作过程中产生的化学自由基团能使某些具有生物活性的物质变性失活，且大容量装置声能传递，散热均有困难，因此只适合实验室小规模破碎脾脏细胞。

1.2机械法：主要通过组织捣碎机、高压均质机等的剪切、挤压作用破碎细胞。有研究表明，该法处理时间短时的细胞破碎率低，只有约30～50%的细胞被破碎，其余的则以单细胞或多细胞形式存在；要达到90%以上的细胞破碎率，需延长处理时间，机械在破碎细胞过程中因摩擦产热使物料温度升高，随着处理时间延长，升温效应越明显，对生产转移因子而言，温度过高会部分破坏其生物活性。

1.3化学法：化学试剂（如盐酸、氢氧化钠等）能溶解细胞壁上的脂类物质，改变细胞壁通透性，由于不能完全破坏细胞壁的结构，细胞破碎不充分，使得细胞内的有效成分释放不完全，提取的转移因子单位产量低。

1.4冻融法：主要作用为冻融破坏了细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性，同时细胞内水的结晶使细胞内外产生溶液浓度差，进而产生渗透压差，并且冰晶也会破坏细胞壁的完整性，从而达到破碎细胞的目的，该方法也存在着化学法中的缺点。

第二阶段，脾脏组织残渣的祛除及转移因子提取，主要方法有：

2.1透析法：是将经破碎处理的白细胞或脾脏细胞液置于透析袋中，在4℃条件下透析24～48h，透析外液即为粗制转移因子。该方法简单、不涉及过滤祛除残渣过程，缺点是目前透析袋批处理能力较小（一般为10mL～500mL/袋）且单位产量低，因此该方法主要用于实验室制备少量转移因子，不适合规模化生产。

2.2加热法：是目前大规模生产转移因子的主要方法，在人药制备转移因子中应用普遍。其方法是将破碎的脾脏细胞液加热至一定温度，利用高温使细胞残渣变性、沉淀，粗滤祛除细胞残渣，取清液部分，清液经逐级过滤而后超滤获得转移因子。缺点是转移因子内的、具有生物活性的小分子物质会被高温灭活，导致其生物活性降低。

另外，还有一些生产方法例如：

醇提取法：取外周血白细胞或切成小块的新鲜淋巴组织(包括脾、淋巴结)，加l倍体积冷却的80%乙醇及3倍体积的40%乙醇，高速捣碎3分钟，调pH至5.0，随后在冰浴中放置30～60分钟后在0～4℃条件下以2500rpm离心20分钟，取其上清液，即为转移因子。该方法缺点是乙醇用量较大，批处理量小，效率低，生产成本高。

超滤法：其主要方法是取新鲜的猪脾脏，经清洗，去脂肪、筋膜等杂质，绞碎后加入适量生理盐水，用高速组织捣碎机捣碎，经检测无完整的细胞后，加入适量的注射用水，经4000rpm离心35分钟后取上清液。对上清液用无石棉的澄清滤板过滤、澄清，澄清液用截留相对分子质量为6000的中空纤维超滤器超滤，收集滤出液，除菌即为转移因子。该方法的主要缺点是细胞液要4000rpm离心35分钟，鉴于目前大容量离心机的每次最大处理溶液量只有6～10L，所以该方法产量低、效率低，难以实现转移因子的规模化生产。