[发明专利]一种重组猪干扰素α1及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪干扰素α1及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、γ三种。其中IFN-α是免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白。在众多亚型中，干扰素α1是最常见的一类，它具有显著的抗病毒、抗肿瘤、抑制造血细胞增殖和免疫调节等功能，适用于病毒感染性疾病（如肝炎）、骨髓增生性疾病、淋巴细胞系肿瘤及其它肿瘤等疾病的治疗。

我国是养猪大国，猪病毒性传染病种类多、危害大，虽然目前我国普遍接种猪病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病。基因工程重组猪干扰素具有广泛的抗病毒效应，并且具有无副作用、无药物残留等优点，在兽药领域具有广泛的应用前景。文献报道猪干扰素α1在抑制口蹄疫病毒活力方面具有明显的作用，但是天然的猪干扰素α1在机体内表达甚微，很难直接从体内大量提取供临床研究及应用。因此本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可以大量表达重组猪干扰素α1表达系统和表达方法。

原核表达系统是最早被采用进行研究的，也是目前掌握最为成熟的表达系统。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但是，原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：例如无法对表达时间及表达水平进行调控、外源蛋白的表达对宿主细胞毒性作用、产物纯化困难等；除此之外，由于原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，产物多以生物活性较低包涵体的形式产生。而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复性的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白的自身性质。如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是：使大肠杆菌表达的猪干扰素包涵体复性为具有生物活性的细胞因子。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达重组猪干扰素α1以及其基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了一种重组猪干扰素α1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了编码上述所述重组猪干扰素α1的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪干扰素α1的基因的载体，所述的载体优选为原核表达质粒，最优选为pET21b。

本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪干扰素α1在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取一个含有上述所述重组猪干扰素α1的大肠杆菌菌落，接入LB培养液，培养过夜；

2.取过夜培养物接入于LB培养液中，震荡培养至对数中期（A₆₀₀=1.0）；

3.在培养物中加入0.5-1mmol/L的IPTG，于37℃，诱导表达1-4h后，离心处理收集含有重组猪干扰素α1的大肠杆菌菌体沉淀。

所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100μg/mL。

本发明还提供了重组猪干扰素α1的包涵体纯化方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的上述含有诱导重组猪干扰素α1大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃高速离心处理；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液BufferA3-10ml，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3.每克（菌体湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。

4.破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4℃高速离心处理，弃上清。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4℃高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次。