[发明专利]快速检测猪乙型脑炎抗体试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于猪乙型脑炎检测技术领域，尤其是一种快速检测猪乙型脑炎抗体试纸条及其制备方法。

背景技术

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis B，JE)，又称流行性乙型脑炎、乙型脑炎，简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种人畜共患的蚊媒传播的自然疫源性传染病。该病对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，可导致患者死亡并常留下严重的神经后遗症。在动物中，猪是JE的主要传染源，对JEV有扩增作用，JEV感染一般呈猪-蚊-人的链状。JE可以引起怀孕母猪流产、死产或弱仔，公猪睾丸炎以及仔猪出现神经症状，给养猪业造成较大的经济损失。JEV广泛分布于亚洲各国，近年来其流行分布范围有不断扩大的趋势，原先无JE的澳大利亚等国已经出现病例。我国是JE发病人数最多的国家，占世界总发病数的80%以上。由于JE流行范围广、人兽共患、危害严重，世界卫生组织（WHO）将其列为需要重点控制的传染病，也是我国医学乙类法定传染病。国际兽医局（OIE）规定JE为必须报告的动物疫病，属二类动物疫病。

JEV属于黄病毒科黄病毒属成员，基因组为正链单股RNA病毒，基因组长度约为11kb(10976bp)，整个基因组只含一个开放阅读框。该多蛋白前体经蛋白酶切割加工，产生3个结构蛋白：核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(PrM／M)、囊膜糖蛋白(E)。E蛋白基因大小为1500bp，由其编码的E蛋白是病毒粒子表面最重要的结构蛋白，其表面的抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白与病毒的毒力、保护性免疫、宿主范围、组织嗜性、膜融合、血凝反应和血清特异性有关。

传统诊断JEV的血清学方法有血清中和试验(SNT)、血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CT)、间接免疫荧光试验(IFA)等，目前较常用有乳胶凝集试验(LAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。这些检测方法存在耗时长、专业性强等缺点，操作需要专门的技术人员和仪器设备，不适合基层使用。因此，建立一种快速、直观、简便、适合基层使用的JEV诊断方法对养猪生产单位具有重要的意义。

免疫胶体金技术(Immune Colloidal gold technique，ICG)是20世纪80年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的一种新型固相标记免疫测定技术。其原理是以胶体金为标记物，利用抗原抗体特异性反应，通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体上直接显示出来，用于检测被检样品中的抗原或抗体。该方法具有特异性强、敏感性高、快速便捷、无需要特殊仪器设备、结果读取判断直观等优点，已成为当前动物疫病检测中广泛采用的免疫学检测方法之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、操作简单便捷的快速检测猪乙型脑炎抗体（JEV抗体）试纸条及其制备方法，以帮助进行JE血清学诊断与血清流行病学调查以及JE感染或免疫后血清抗体的检测。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：快速检测猪乙型脑炎抗体试纸条，由吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、样品垫、支持物组成，硝酸纤维素膜含有由JEV E蛋白包被而成的检测线和由羊抗JEV抗体包被而成的对照线，玻璃纤维素膜结合有胶体金标记的JEV E蛋白。

用于包被检测线的JEV E蛋白浓度为1.56mg/mL，用于包被对照线的羊抗JEV抗体浓度为2mg/mL。

玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸按照以下次序相连接并附着在支持物上面，玻璃纤维素膜与靠近硝酸纤维素膜检测线的一端相连接，吸水纸与靠近硝酸纤维素膜对照线的一端相连接；样品垫附着在玻璃纤维素膜上，样品垫的一端与硝酸纤维素膜相连接。

硝酸纤维素膜上的检测线和对照线的直接间隔为3～5mm，4mm最佳。

支持物要求具有一定硬度，便于将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸负载于其上，能够达到支持和负载的目的即可。支持物首选塑料板（PVC），也可以选择铝板、硬纸板作为支持物。

上述快速检测猪乙型脑炎抗体试纸条的制备方法，包括以下步骤：

<1>JEV E蛋白的制备 可按照常规基因工程手段进行，如E基因重组质粒诱导表达蛋白，以亲和层析法对重组蛋白进行纯化，谷胱甘肽还原法进行复性，经透析、浓缩及紫外分光度计测定后备用；