[发明专利]一株植物乳杆菌CCL67及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物微生物领域，涉及一株植物乳杆菌CCL67及其应用，特别涉及一株从鸡肠道中分离出来的植物乳杆菌CCL67及其应用。

背景技术

乳酸菌是一类重要的益生菌，是动物肠道中一类重要的优势菌群。乳酸菌制剂作为一种新型的绿色动物微生态制剂，因其无毒、无抗药性、无残留、无副作用而备受饲料界的广泛关注。

采用乳酸菌作为益生菌饲喂动物，除了由于乳酸菌具有一定的营养作用和对肠道的粘附作用外，主要在于乳酸菌对于一些腐败菌和有害菌具有抑制作用。第一，乳酸菌可以产生乳酸，创造酸性环境抑制有害菌及不耐酸的腐败菌生长；第二，乳酸菌产生H₂O₂，激活过氧化氢酶—硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌等；第三，部分乳酸菌可以产生抑菌性的细小蛋白质或肽类，称为细菌素，对大肠杆菌等致病菌有拮抗作用。而且，有了产生抑菌蛋白的乳酸菌，就可以生产细菌素，可以替代抗生素，使动物生产更安全。分离筛选可以产生细菌素的乳酸菌成为现在益生菌开发的研究热点。

产生细菌素的乳酸菌来源很多，购买的工业菌株和标准菌株，有很多也可以产生细菌素，环境、土壤、泡菜、酸奶中都可以分离乳酸菌。然而益生菌最后要饲喂动物，那么相对于其他来源的菌株，动物无疑是乳酸菌的最好来源。来自动物肠道的乳酸菌可以适应动物肠道环境，耐受动物的胃酸和胆盐的消化，无疑是最好的益生菌来源。可见，通过从动物肠道分离和筛选能够产生细菌素的乳酸菌将是动物用益生菌筛选的重要研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CCL67，其保藏编号为CGMCC No.6996。

本发明的第二个目的是提供上述植物乳杆菌CCL67具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、促进雏鸡生长的作用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CCL67，其保藏编号为CGMCC No.6996。

本发明中植物乳杆菌CCL67为革兰氏阳性，形态为杆状，是从笼养成年蛋鸡盲肠内容物中分离的乳酸杆菌菌株，经过产抑菌蛋白等特性测定筛选得到的目标菌株。

筛选的具体步骤如下：

1、乳酸菌分离纯化：

采用无菌操作，用载玻片刮取笼养成年蛋鸡盲肠内容物1g，置于盛有9mL无菌生理盐水的玻璃试管中，充分震荡摇匀，然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10^-1，重复以上过程作10倍比稀释，至10^-6稀释浓度，选择10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，吸取0.lmL菌液滴于MRS培养基平板上，平板涂布后采用厌氧培养法（5%CO₂）将涂好的培养皿置37℃培养箱培养48h。采用四分区划线法，用接种环挑取形态不同的菌落在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，经48h培养后，在四分区中挑取分离效果好的菌落用接种环接种于MRS斜面培养基上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4℃冰箱保存备用。

2、菌体形态的观察

取干净玻片，用接种环取一环无菌水于玻片上，而后挑取少量细菌，涂匀，待干燥后，固定。革兰氏染色：先用草酸铵结晶紫染液染色1min，用水冲洗，接着滴加卢氏碘液覆盖1min，用水冲洗，然后滴加95%乙醇至乙醇液不呈现紫色时停止约0.5min，最后用番红染液复染1min，水洗。油镜镜检（16×100），选取革兰氏染色为阳性、形态为杆状或球状的菌株做后备菌株留用。

其中，革兰氏染色试剂配制：

①草酸铵结晶紫染色液的配制

A液结晶紫2g95%酒精20mL

B液草酸铵0.8g蒸馏水80mL

混合A、B液，静置48h之后使用。

②卢氏碘液

碘片1g碘化钾2g蒸馏水300mL

先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后加足水即可。

③95%酒精

④番红复染液

番红2.5g95%酒精100mL

取上述配好的番红酒精10mL与80mL蒸馏水混匀而成。

3、抑菌性乳酸菌的筛选：