[发明专利]胶原/纤维蛋白胶-VEGF与间充质干细胞复合构建的双层皮肤覆盖物及制备方法和应用

权利要求书

1.胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物，其特征在于该双层皮肤覆盖物包括胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架和UCMSCs的活性层，其中VEGF分布在纤维蛋白胶层，两层具有不同的孔隙率。

2.权利要求1所述胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物，其中胶原层孔隙直径为（130.0±24.5）μm，胶原层厚度为（0.18±0.045）cm，胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架材料厚度为（0.25±0.095）cm。

3.权利要求1所述胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物，其中胶原层孔隙率为（74.8±10.8）%，胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架的孔隙率为（64.5±6.9）%。

4.权利要求1所述的胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于包括胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架的制备，步骤如下：

（1）胶原溶胀液与丙二酸溶液配制质量浓度为0.3%~1.0%的胶原溶液，搅拌均匀后注入不锈钢模具，预冻后冷冻干燥得到胶原海绵状固体；

（2）将上述胶原海绵状固体浸入戊二醛溶液进行化学交联，清洗后再次进行冷冻干燥制备得到胶原多孔支架；

（3）将胶原多孔支架装入聚乙烯薄膜小袋中，封口后γ射线⁶⁰Co，2×10⁶rad辐射灭菌；

（4）将VEGF的PBS溶液与纤维蛋白原混合成含VEGF 1mg/ml后，加入凝血酶，制备纤维蛋白胶；

（5）将上述纤维蛋白胶迅速加入胶原支架层，静置20分钟形成胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架。

5.根据权利要求4所述的胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架的制备步骤（1）中胶原溶液的质量浓度优选为0.3%，0.6%，0.9%。

6.根据权利要求4所述的胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架的制备步骤（2）中化学交联的条件优选为戊二醛溶液体积百分比0.3%， 20℃，12小时。

7.根据权利要求4所述的胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架的制备步骤（5）中的纤维蛋白胶加入胶原支架的量为0.2ml/cm²-1.0 ml/cm²，加入时间控制为1.0-2.0秒。

8.权利要求4所述的胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于还包括胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架复合UCMSCs的制备，步骤如下：

（1）分离脐带间充质干细胞， 用DMEM低糖培养基培养至第三代对数期，离心收集细胞；

（2）加入培养基制成细胞密度为5.0×10⁵个/ml~5.0×10⁷个/ml的细胞悬液，滴加到胶原/纤维蛋白胶-VEGF双层支架的纤维蛋白-VEGF层，加入细胞悬液的量为0.1ml/cm²-1.0 ml/cm²；

（3）加入培养基浸没胶原层，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的恒温培养箱中孵育0.5~4小时。

9.根据权利要求1所述的胶原/纤维蛋白胶-VEGF复合UCMSCs双层皮肤覆盖物在构建组织工程皮肤中的应用。