[发明专利]凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白和应用。

背景技术

金属硫蛋白(metallothionein，MT)的化学名称为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一类普遍存在于生物体内的低分子量(6-7kDa)、富含半胱氨酸、热稳定性、可诱导型非酶蛋白。1957年，Margoshes和Vallee首先在马肾细胞中发现MT；1977年，Casterline和Barnett在大豆根中发现了植物中的第一个MT，随后陆续又在糠穗草、番茄等植物中发现了植物金属硫蛋白，现已在多种真核和原核生物中发现了MT基因和蛋白。金属硫蛋白富含Cys，能够大量结合二价重金属离子，具有很强的金属结合能力和氧化还原能力，在生物体内主要参与微量元素储存、运输和代谢，重金属解毒，拮抗电离辐射，清除自由基，以及机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤发生、免疫、应激反应等生理生化反应。其研究和开发利用涉及农业、医药、生物工程、环境保护等各个领域，具有重要的应用价值，金属硫蛋白也因此成为生命科学研究的热点之一。与此同时，许多海洋生物体内都含有MTs或类金属硫蛋白(MTLPs)，至今已发现，1979年，首次报道了美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的MT，此后又陆续60多种无脊椎动物中存在着MTs。目前为止，在大多数主要无脊椎动物中都发现了MTs，不同物种间的MT存在显著的差异，表现多种生理生态功能。

凡纳滨对虾又称南北白对虾，由于其具有繁殖期长；广盐性；广温性；可以密养产量高；抗病力较强；耐干性较强；肉质鲜美；个体较大等优点目前已经成为全球第一大养殖对虾，并且也是我国对虾养殖的主导品种。使凡纳滨对虾一跃成为养殖最多的品种。近年来养殖产量有很大提高，从2001年以来，我国养殖凡纳滨对虾面积和产量一直居于对虾养殖的首位。2009年凡纳滨对虾养殖产量约110万吨，占对虾总产量的87%，其中我省养殖产量超过四十万吨，所占比例接近40%。凡纳滨对虾的生长受环境的影响非常明显，比如温度、含氧量以及重金属等因素。为了减少生态环境中重金属对于凡纳滨对虾的影响，金属硫蛋白作为重金属筛查的一种特殊生物标记也有较多研究。然而凡纳滨对虾的MT基因筛选报道较少，且MT基因的鉴定和功能分析至今未有报道。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT及其编码蛋白。

本发明的凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的凡纳滨对虾金属硫蛋白LvMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

本发明的第二个目的是提供一种含有凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT的重组表达载体。

所述的表达载体优选为原核表达载体pET-32a。

本发明的第三个目的是提供一种转化有含有凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT的重组表达载体的宿主细胞。

所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21。

本发明的第四个目的是提供凡纳滨对虾金属硫蛋白基因LvMT在抗重金属方面的应用。

本发明根据抑制缩减杂交文库中的凡纳滨对虾MT基因的EST全长基因序列，设计了特异性引物，再提取凡纳滨对虾腮组织的RNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，采用上述特异性引物进行PCR扩增出LvMT基因片段，采用琼脂糖凝胶电泳回收片段，连接于pMD18-T载体上，获得重组载体pMD18-LvMT，测序分析，该序列包含一个开放阅读框，为177个碱基，其序列如SEQ ID NO.1所示，将此基因命名为LvMT，其编码蛋白具有58个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为LvMT，再将LvMT基因片段连接到原核表达载体pET-32a中，再用化学法将含有LvMT基因的原核表达载体pET-32a转入大肠杆菌中，筛选阳性菌株扩大培养后利用IPTG诱导表达金属硫蛋白，将诱导表达后的阳性菌株涂布含不同重金属浓度的LB固体培养基平板，37℃培养，平板上的菌落数目明显多于没有转入LvMT基因的大肠杆菌。