[发明专利]一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体及制备方法及用途

权利要求书

1.一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体，是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。

2.一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2；

（2）采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2总mRNA，以oligo(dT)₁₈为引物，逆转录合成cDNA；

（3）在相对保守的frame1区和frame4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞2C2表达的单抗的轻链可变区基因的用SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的上、下游简并引物，以及重链可变区基因的用SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的上、下游简并引物；以cDNA为模板，PCR扩增获得轻链可变区基因和重链可变区基因，分别克隆至pUC-T simple载体，经测序及IMGT/V-QUEST、BLAST分析，确认所获序列符合鼠源抗体可变区经典结构，均为功能性V（D）J重排模式，其中，轻链可变区基因为SEQ ID No.2所示，其编码的多肽为SEQ ID No.3所示；重链可变区基因为SEQ ID No.4所示，其编码的多肽为SEQ ID No.5所示；

（4）结合二硫键稳定的重构抗体突变位点设计原则，设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示，以SEQ ID No.2所示序列为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示，以SEQ ID No.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引入Kozak序列；

（5）经酶切、连接，将步骤（4）获得的修饰的重链可变区基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，获得pcDNA3.1-V_H过渡载体；另以pIRESneo质粒为模板，以SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示核苷酸为上、下游引物，通过PCR扩增获得ivs-IRES序列；同时以步骤（4）获得的修饰的轻链可变区基因序列和ivs-IRES序列为模板，以SEQ ID No.12所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID No.17所示核苷酸为下游引物，采用两步法重叠PCR方法，扩增获得带有后续重组操作BamHI和Xba I酶切位点的ivs-IRES-V_L融合基因片断，经酶切、连接，插入所述pcDNA3.1-V_H过渡载体，构建真核单启动子共表达重组质粒p2C2HILO，其中，5`-V<sub>H</sub>-ivs-IRES-V<sub>L</sub>-3`融合序列如SEQ ID No.6所示，p2C2HILO如SEQ ID No.7所示；

（6）通过Lipo2000脂质体介导瞬时转染哺乳动物细胞BHK-21细胞系，经PCR鉴定和G418抗性筛选，获得稳定表达分泌细胞系。

3.权利要求1的抗体在葡萄球菌肠毒素检测中的应用。

4.权利要求1的抗体在细胞间接免疫荧光检测中的应用。

5.权利要求1的抗体在流式细胞术检测中的应用。