[发明专利]一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法

说明书

技术领域

 本发明属于南美蟛蜞菊的体外繁殖技术领域，涉及植物叶片的快速产生不定根及再生苗的“两步成苗”的方法。

技术背景

南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata (L.) Hitchc.)是菊科蟛蜞菊属 (Wedelia)一种常绿地被植物，原产南美洲，因其植被覆盖度高，常年开花，最初作为绿化植物被引入我国。近些年，其生长迅速，在华南地区逃逸成有害杂草。目前对于南美蟛蜞菊的研究，文献报道甚少，其大多数的研究在于其生态种群、花发育及种子繁殖等方面的研究，而在分子水平上的研究较少。运用转基因的方法对南美蟛蜞菊的各种不同形状进行遗传改造，变害为宝，并培养出更多有价值的品种，这将对华南地区的绿化有重要的意义。

体外繁殖技术是遗传转化体系的基础，其在培育优良种质和濒危物种的繁殖及利用等方面有重大的意义。目前，对南美蟛蜞菊的体外繁殖的研究，还存在着周期长，诱导率低等缺点，因此建立快速高效的南美蟛蜞菊的体外繁殖体系势在必行，并旨在为分子水平的研究打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效的南美蟛蜞菊叶片不定根的诱导及再生植株的培养基配方和方法。

本发明是通过以下技术方法实现的，一种南美蟛蜞菊体外快繁的两步法，按照下述步骤进行：

(1)  取南美蟛蜞菊长势较好的无病虫害的叶片用蒸馏水冲洗干净，用75%(v/v)乙醇擦拭叶片，再用蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌操作台上；

(2)  用70%-75%(v/v)乙醇浸泡1 min，并不断地摇动，后倒掉乙醇，加入0.1%(v/v)的升汞(HgCl₂)浸泡6-8 min，倒掉升汞，灭菌蒸馏水冲洗3-5次，置于无菌培养皿中；

(3)  用剪刀将叶片边缘剪掉，将叶片剪成长1 cm左右的长方形，叶背向下接种于不定根诱导的培养基上，并将切口紧贴培养基，每个培养皿接种3-4片叶片，培养皿封口后，置于光照培养箱中进行不定根的诱导，培养温度24℃，光照周期16/8 h，湿度70%。

(4)  5-6 d后叶边缘及叶脉开始生长少量的愈伤组织，8-10 d 颗粒状的愈伤组织上开始产生不定根，取生长不定根的紧密的愈伤组织转移到不定芽分化培养基上进行不定芽的诱导。

(5)  5-10 d 左右产生丛生芽，10-15 d得到完整的南美蟛蜞菊植株。

其中步骤(3)中诱导不定根培养基配方如下： MS + NAA 8-15 mg/L，即1L的MS培养基中含有8-15 mg的NAA；

    其中步骤(4)中不定芽分化培养基配方如下： MS + 6-BA 2-5 mg/L + IAA 0.1-0.5 mg/L+脯氨酸800-1200 mg/L ，即1L的MS培养基中含有2-5 mg的6-BA, 0.1-0.5 mg 的IAA和800-1200 mg的脯氨酸。 

本发明提供的南美蟛蜞菊的体外繁殖的方法，不仅解决了南美蟛蜞菊的不定芽诱导的困难，并且具有以下优点：

先迅速诱导不定根的产生，再通过6-BA，IAA 和脯氨酸的配比，诱导丛生芽的产生，迅速产生新的植株。

其中 MS：MS (Murashige and Skoog)培养基；

     NAA：萘乙酸 (1-naphthlcetic acid)；

6-BA：6-苄氨基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine)；

     IAA：吲哚-3-乙酸 (indole-3-acetic acid)。

 

附图说明

图1为诱导南美蟛蜞菊不定根及丛生芽效果图，其中：1为南美蟛蜞菊叶片外植体(1天)；2为南美蟛蜞菊愈伤组织(5天)；3.为南美蟛蜞菊外植体快速生根(10天)； 4为南美蟛蜞菊成苗(20天)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细描述：

实施例1