[发明专利]一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法

说明书

技术领域

本项发明涉及一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法，适用于淡水养殖池塘水质净化和渔业增产。

背景技术

池塘集约化养殖模式下，大量投喂配合饲料，其中的氮磷仅有9.1% 和17. 4%被鱼类同化，残留饲料和鱼类排泄物形成水体污染物，危害水生动物生长发育，诱发多种疫病，造成水产品质量下降。如何净化和回用养殖废水已成为制约渔业经济发展的技术瓶颈。

利用小球藻等微藻处理水产养殖废水，一方面可以净化污水，另一方面可以获得有价值的藻类，促进养殖业的可持续发展。蛋白核小球藻（Chlozella pyrenoidosa）粉粗蛋白含量63%，不仅是一种高效的污水处理物种，也是一种优良的生物饵料资源。Domenico等利用小球藻在光暗循环为14∶10的条件下处理模拟氨氮废水，发现氮的去除过程主要发生在有光的时段。小球藻去除水体污染物效果的好坏取决于其光合活性，并受控于氮、磷初始浓度、水温、光强、进水负荷、停留时间等一系列基本参数。虽然小球藻在处理水产养殖废水中显示了其优越性并取得了很大进展，但仍然存在一些问题有待解决。其中，选育和改良具有高效净化能力、营养价值高的新型小球藻藻种是重要的研发方向。

发明内容

本发明旨在提供一种淡水小球藻诱变培育方法，该方法可有效地诱变培育出水质净化能力强的小球藻高产优势藻株。

为实现上述目的，本发明提供的一种淡水小球藻诱变培育方法包括以下步骤：

（1）前培养：吸取1ml液体原藻种接种到含30ml HB-4液体培养基的三角瓶中进行诱变前的活化培养,无菌操作，于27℃±1 ℃、 光照强度30001ux、光照周期为12h∶12h条件下光照培养至对数生长期备用。

（2）诱变处理：在HB-4培养液中添加不同浓度秋水仙碱，制成0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 6个浓度梯度的小球藻诱变培养液，接种原藻种后于温度27℃±1 ℃、140r/min、光照强度3000lux、光照周期12h∶12h条件下，分别培养6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120h进行诱变处理。

（3）初筛和恢复培养：每一时间水平诱变结束后，离心分离经诱变的藻细胞，接种到HB-4液体培养基，于27℃±1 ℃、140～170r/min、光照强度30001ux，光照周期为12h∶12h、通气条件下进行恢复培养，每隔6h测定OD_530nm值，以OD_530nm峰值出现最早和峰值最大的实验组为优势突变组。

（4）复筛和纯化培养：运用涂布平板法，将将初筛获得的小球藻转接到HB-5固体分离培养基上进行分离培养，挑选色泽浓绿、半径大的藻株群落，获得优势突变型小球藻纯藻株，转接到试管内HB-4固体斜面培养基上纯化培养。

（5）性能检测：经分离筛选的藻株进行下面各项指标的检测：

①小球藻核及叶绿体DNA含量检测；

②小球藻叶绿素含量检测；

③小球藻稳定期藻细胞浓度测定；

④小球藻胞内可溶性蛋白质含量鉴定；

⑤小球藻水质净化效能鉴定。

附图说明

以上给出了本发明的一种通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，下面以具体实施方式并结合附图对本发明作详细描述。

图1 小球藻核及叶绿体DNA的流式细胞仪测定结果。

具体实施方式

（1）前培养：吸取1ml液体原藻种接种到含30ml HB-4（配方见表1和表3）液体培养基的三角瓶中进行诱变前的活化培养，无菌操作，于27℃±1 ℃、光照强度30001ux、光照周期为12h∶12h条件下培养至对数生长期备用。

表1 HB-4配方

    

表2 HB-5配方

表3 A5配方

 

（2）诱变处理：称取0.10g秋水仙碱于50mL烧杯中，用10mL无菌水溶解，转入100mL容量瓶中，用无菌水定容至刻度，经摇匀制得秋水仙碱溶液。

秋水仙碱结构简式：