[发明专利]薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基及其测定花粉活力的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物花粉活力测定技术领域，尤其涉及一种薄壳山核桃花粉离体萌发的液体培养基，以及利用该培养基测定薄壳山核桃花粉活力的方法。 

背景技术

薄壳山核桃(Carya illinoinensis)为胡桃科(Julandaceae)山核桃属(Carya nutt)植物，又名美国山核桃、长山核桃。薄壳山核桃是世界著名的干果树种之一，其坚果个大、壳薄，出仁率高，取仁容易，产量高。薄壳山核桃亦是重要的木本油料植物，其油脂含量高达70%以上，不饱和脂肪酸含量高达97%，是上等的烹调用油。薄壳山核桃还是优良的材用和庭园绿化树种，其木材纹理细腻，质地坚韧，是建筑、军工、室内装饰和制作高档家具的理想材料；其树形高大、树势挺拔，是深受欢迎的观赏、遮荫和行道树种。薄壳山核桃原产于美国和墨西哥北部，现以美国为中心产区，分布于美国、加拿大、墨西哥、巴西、阿根廷、秘鲁、意大利、法国、澳大利亚、埃及、南非、以色列、日本、中国等地。 

薄壳山核桃引种至中国已有100多年，至今未能形成产业化，开展良种选育是一项重要的工作。进行薄壳山核桃花粉活力测定的研究，对种质资源保存与创新、优良品种的选育具有理论和实践意义。 

薄壳山核桃为雌雄同株异花植物，大多品种雌雄异熟。因此在杂交育种过程中，需要对采集的花粉进行贮藏，贮藏后花粉的活力关系到人工授粉的成败。花粉活力测定的主要方法有染色法和离体萌发法。 

染色法是通过使用山色试剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高低，常用的染色试剂有I2-KI溶液和氯化三苯基四氮唑(TTC)等。目前已有对薄壳山核桃花粉进行TTC染色测定其活力的报道，但由于染色法只能反映花粉的代谢情况或营养物质含量，且颜色判断误差较大，并不能直接准确地表现花粉的活力。 

花粉离体萌发法提供的条件与花粉在柱头萌发的条件更为接近，是检测花粉活力最为可靠的方法。花粉离体萌发需要适宜的培养基及培养条件，常用的培养基组分为蔗糖、硼酸，温度20℃~25℃。 

薄壳山核桃花粉萌发困难，现有技术一直未能突破。在胡桃科植物中，仅见于对核桃(Juglans regia L.)花粉的花粉萌发进行了研究，但萌发率最高仅为2.22%，不能准确地反映花粉活力。 

发明内容

解决的技术问题：提供一种薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基及其测定花粉活力的应用，在确定薄壳山核桃花粉离体萌发培养体系的基础上，对薄壳山核桃花粉离体培养，并能够可靠有效的测定薄壳山核桃花粉活力。 

技术方案： 

一种薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基，该培养基以蒸馏水为溶剂，内含蔗糖、H₃BO₃和Ca(NO₃)₂·4H₂O。 

所述溶质由200g/L的蔗糖、200~300mg/L的H₃BO₃和500mg/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O组成。 

上述培养基测定花粉活力的应用，包括以下步骤： 

1)花粉采集 

选择发育正常、无病虫害的健壮薄壳山核桃植株，在花药变黄时采摘雄花花序，将其摊在硫酸纸上，置于避风干燥处，次日花药即可散粉；筛出花粉，装入密封袋中，冷藏备用； 

2)花粉复水处理 

在密闭的容器中，用K₂SO₄或CuSO₄·5H₂O饱和盐溶液调节相对湿度RH=97%，将花粉放置于该容器中，进行4~8h的复水处理； 

3)花粉离体萌发及花粉管生长 

同时配制液体培养基，其组分为：200g·L^-1的蔗糖＋200～300mg·L^-1的H₃BO₃＋500mg·L^-1的Ca(NO₃)₂·4H₂O；在凹槽载玻片上滴加50μL液体培养基，用大头针蘸取已复水处理的花粉使其均匀地撒在培养基上，将载玻片放入铺有湿润脱脂棉的培养皿内，在黑暗、25℃条件下保湿培养；4h后花粉开始萌发，花粉管伸长生长，24h后花粉生长趋于稳定； 

4）花粉活力的测定