[发明专利]用于分离细胞外核酸的快速方法

说明书

产生本发明的工作接受了欧洲共同体第七框架计划(European Community's Seventh Framework Programme)(FP7/2007-2013)的资助协议号222916下的资助。

技术领域

本文所公开的发明涉及从样品、尤其是血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清分离细胞外核酸的方法以及相关的技术。

背景技术

已在血血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由于它们受到保护而免受核酸酶影响(例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白质结合或被包含在囊泡内)这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。许多医学病症、恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应来说，是尤为令人感兴趣的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别同一性、评估染色体异常和监测妊娠相关的并发症。除了例如源自于肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸之外，包含细胞外核酸的样品还可能包含未包含在细胞内的其他目标核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。病毒核酸从样品例如尤其是血液样品或源自于血液的样品的有效分离，对于许多诊断应用来说也是重要的。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性(例如胎儿来源或肿瘤来源的核酸)。然而，在健康人类中也发现了细胞外核酸。细胞外核酸的常见应用和分析方法被描述在例如下述文献中：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等，FEBS Letters581(2007)795-799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)，Fleischhacker和Schmidt，Biochmica et Biophysica Acta1775(2007)191-232，Hromadnikova等，(2006)DNA and Cell biology,Volume25,Number11pp635-640；Fan等，(2010)Clinical Chemistry56:8。

因此，为了允许可靠的分析，细胞外核酸的有效分离是极为重要的。然而，细胞外核酸通常仅仅以低浓度包含在样品中。例如，自由循环的核酸以1-100ng/ml血浆的浓度存在于血浆中。此外，细胞外核酸通常作为大小为500nt、300nt(当指示尺寸以及因此链长时，术语“nt”在DNA的情形中也包括“bp”)或甚至更小的片段(循环核小体)循环。此外，出于诊断目的打算鉴定的真正的目标细胞外核酸通常仅占总细胞外核酸的一小部分。例如，肿瘤特异性DNA片段非常稀少，并且通常以比“正常”细胞外核酸背景低1000倍的浓度被包含。因此，希望处理大样品体积以便获得足够量的细胞外核酸，尤其是足够量的包含在其中的稀有目标分子，以用于下游测定。

在现有技术中，已知几种用于从样品例如尤其是血浆样品分离细胞外核酸的方法。在这里，几种试剂盒也是可商购的。然而，尽管这些试剂盒提供了有用的结果，但它们也具有需要改进的缺点。

例如，QIAamp循环核酸试剂盒允许处理高达5ml的样品量，用于分离细胞外核酸。然而，它需要手动核酸提取。自动进行大体积样品的制备是困难的，这是由于所使用的化学试剂(裂解和结合缓冲液)造成相应的试剂盒需要操控高达25ml的总处理体积。然而，标准的机器人系统仅处理最大3ml的体积。此外，相应的试剂盒还需要几个方法步骤。因此，不但允许处理大样品体积而且同时允许自动进行分离过程的方法，将是有利的。旨在从无细胞样品例如血浆分离例如病毒核酸的其他可商购试剂盒，只能处理相当小的样品体积(参见例如EasyPlex^TM病毒试剂盒)。在这里，较大样品体积的处理将是有利的，因为这将允许提高核酸得率。