[发明专利]在真核细胞中产生基因嵌合体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过真核细胞内的部分同源体内重组产生基因嵌合体的方法。

背景技术

蛋白质设计的一个主要目标是产生具有新性质或改良性质的蛋白质。赋予蛋白质或酶所需活性的能力在化学和制药行业有大量的实际应用。定向蛋白质进化在蛋白质工程中作为强大的技术平台出现，其通过实验搜寻变体库中具有所需性质的克隆。

定向蛋白质进化利用自然选择的力量来使自然界中没有找到的带有所需性质的蛋白质或核酸进化。已有各种技术用于产生蛋白质突变体和变体以及用于选择所需的功能。重组DNA技术能够将单个结构基因或一整个途径的基因转移到合适的代理宿主(surrogate host)中用于快速增殖和/或高水平蛋白质生产。活性或其它性质的累积性改进通常通过重复突变和筛选来获得。定向进化主要应用在学术和工业实验室中以改进蛋白质的稳定性和增强活性或增强酶和生物体的整体性能，或改变酶底物特异性，以及用以设计新的活性。大多数定向进化项目试图使在农业、医学或工业环境(生物催化)方面对人类有用的性质进化。

整个代谢途径的进化是一个特别具有吸引力的概念，因为大多数天然或新的化合物都是通过各种途径而不是通过单酶产生的。代谢途径工程通常需要途径中的所有酶的协同操作。新代谢途径的进化和生物处理的增强通常是通过重组和筛选或选择的重复循环过程来进行的，以使单独的基因、整个质粒、多基因簇或甚至整个基因组进化。

Shao等人(Nucleic Acids Research37(2):e16Epub2008Dec12)[Shao等人(2008年12月12日电子出版的《核酸研究》37卷第2期e16页)]描述了编码整个生化途径或基因组的大重组DNA的组装，其在单个步骤中在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中通过5'和3'末端的两个旁侧(锚定)区域的体内同源重组进行组装，所述区域包含相邻片段的5’或3'末端的序列。

Elefanty等人(Proc.Natl.Acad.Sci.95,11897-11902(1998)[Elefanty等人(《美国科学院院刊》1998年95期第11897-11902页)]描述了基因靶向技术以产生突变小鼠，其中lacZ报告基因被敲入SCL基因座。参考他们的文章的图1，显示了SCL-lacZ基因靶向策略，其采用两个锚定序列，即5'和3'末端各一个锚定序列。

定向进化可在活细胞中进行，称为体内进化，或根本不包含细胞(体外进化)。体内进化具有在细胞环境中选择性质的优势，当进化的蛋白质或核酸是用在活生物体中时，这很有用。酵母中的体内同源重组已广泛用于基因克隆、质粒构建和文库建立。

文库差异性(diversity)通过诱变或重组获得。DNA改组(DNA shuffling)能够直接重组多基因的有利突变。在DNA改组中，DNA序列群随机片段化，然后重组装成全长杂交序列。

为了达到同源重组的目的，使用天然存在的同源基因作为起始差异性的来源。单基因改组文库成员通常超过95％相同。但是，家族改组能够使通常超过60％相同的序列进行块交换。功能性序列差异性来自于相关的从自然选择中存活下来的亲本序列；因此，在一给定的序列中，能容纳数量大得多的突变而不会对结构或功能造成不利影响。

高达30％差异性的不同来源的DNA片段的重组描述于WO1990007576A1中。杂交基因通过属间和/或种间重组，在错配修复缺陷细菌中或在错配修复(MMR)系统短暂失活的细菌中在体内产生。从而，避免了受损DNA的修复过程，否则，将会对不同序列之间的重组频率产生抑制作用，即，部分同源重组。

Kunz等人(Cell.Mol.Life Sci.66(2009)1021-1038)(《细胞和分子生命科学》2009年第66期第1021-1038页)提供了MMR基本机制的综述。

靶向半同源重组描述于《MMR deficient plants(MMR缺陷植物)》中(WO2006/134496A2)。用高达10％差异的序列靶向一基因座是可能的。

WO03/095658A1公开了同源重组到细菌中用于产生多核苷酸文库。其产生了一多核苷酸的表达文库，其中每个多核苷酸通过同源重组整合到感受态细菌宿主细胞的基因组中，其使用包含该多核苷酸和与宿主细胞基因组的区域同源的两个旁侧序列的非复制型线性整合盒(cassette)。