[发明专利]犬源化肿瘤坏死因子抗体及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及充当犬肿瘤坏死因子α抑制剂的结合抗体及其片段。本发明延及制备这些抗体及其片段的方法以及这些结合抗体和片段在治疗犬的由肿瘤坏死因子介导的慢性炎症病症如关节炎中的治疗用途。

发明背景

肿瘤坏死因子α(TNF-α、TNF-α、TNF)是在免疫、炎症、细胞增殖控制、分化和细胞凋亡方面发挥多效性功能的有效细胞因子。已经证明，使用肿瘤坏死因子受体(TNFR)免疫球蛋白Fc结构域融合蛋白或抗TNF中和单克隆抗体抑制TNF是治疗包括风湿病关节炎和银屑病性关节炎在内的各种人炎性疾病的成功的治疗途径。

宠物动物如狗会发生类似的炎性疾病，包括骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎、血浆-淋巴细胞滑膜炎、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎和各种自身免疫性皮肤疾病。据估计，在美国五分之一的成年狗有关节炎，并且狗被用作人关节疾病如骨关节炎、前交叉韧带撕裂和半月板损伤的模型。

已有大量的文件证明TNF在狗发生炎症中的作用。例如，封闭的胸部模型中由球囊闭塞引起缺血再灌注后，用TNF抑制剂依那西普(huTNFR-Fc)处理狗，使心肌损伤降低约25-40％，同时伴随有相关的炎症标记物如ICΑM-1和NF-kB的减少。同样，也已经证明，在缺血-再灌注的开胸狗模型中使用2mg/kg TNFR-Fc，梗死面积降低60％。

而且，在患有膝关节炎的狗的滑液的细胞浸润物中，TNF-α的分泌增加。已经显示，在患有青光眼的狗的中心视网膜和外围视网膜中，作为广泛的炎性反应的一部分，TNF受体和II型TNF受体显著增加。抗犬TNF MAb已用于通过捕捉ELISA法检测用LPS处理的犬PBMC的上清液中低水平的TNF。还报道过，在犬血管外皮细胞瘤、成视网膜细胞瘤(tricoblastoma)、脂肪瘤和肥大细胞瘤的皮肤样品中存在TNF-α表达。在骨关节炎的诱导模型中，犬关节软骨中存在TNF-α受体和TNF受体。已经在患剥脱性皮肤型红斑狼疮(ECLE)的两只狗中测试了抗TNF的人源化单克隆抗体阿达木单抗(每两周0.5mg/kg，共8周)，但是疾病进展照旧且血清TNF-α水平无变化。

由于TNF参与犬的各种炎性介导的病症，因此需要可用于长期抑制TNF的犬TNF抑制剂，从而预防或治疗所述慢性炎性病症。

发明概述

经过大量的努力，本发明人意外地确定出一种制备抗体的方法，该方法产生了特异性结合犬TNF且中和犬TNF的生物活性的抗体和结合片段。特别是，本文表明，尽管在该抗体的框架区中引入了大量的氨基酸修饰，由于这些修饰是以新颖的和创造性的方式作出的，因此本发明的抗体和结合片段仍然以高特异性结合犬TNF。进一步证明，该结合通过抑制犬TNF与TNF受体表达的细胞膜结合来使犬TNF的生物活性减退。因而，这将能够预防犬的TNF介导的诱导的发生、炎性介导的疾病如关节炎的发展或进展。

使用重组DNA方法生产本发明的抗体，且本发明的抗体显示对犬TNF的结合特异性，同时还具有犬的框架和恒定结构域序列，以降低将其施用至犬宿主时它们的免疫原性。结果，使异种抗体诱导的风险最小。由于使用标准方法如CDR移植等不能产生该抗体，因此对犬TNF的结合特异性完全是出人意料且意想不到的。

根据本发明的第一方面，提供了特异性结合犬肿瘤坏死因子(TNF)犬源化抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，通过下述方法制备该抗体，其包括或基本上由以下步骤组成：

-提供来自犬之外的物种的供体抗体，其中所述供体抗体对肿瘤坏死因子具有结合特异性；

-将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与存在于一个或多个犬抗体框架区的氨基酸序列中对应位置的每一氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体受体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个犬抗体框架区的氨基酸序列的对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及

-用存在于一个或多个犬抗体中对应位置的一个或多个氨基酸残基取代所述供体抗体中一个或多个鉴别出的氨基酸残基。

上述方法修饰了犬中使用的供体抗体，通过这种方式使得修饰的抗体的框架区内的任何位置不含有对犬中的该位置而言是外来的任何氨基酸。因此，修饰的抗体保留了供体抗体对靶抗原的特异性和亲和性，但重要的是这种修饰并没有产生潜在的外来表位。因此，犬中修饰的抗体并不视为是外来的，并因此没有引起可能导致中和抗体功效的免疫反应，尤其是在长期施用后。