[发明专利]运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白质及其生成和使用方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年8月17日提交的美国临时申请No.61/524,508的优先权权益，此文整体附此作参考。

发明领域

本发明涉及重组蛋白及其生成和使用方法，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素或其他抗血管生成蛋白的运铁蛋白。本发明还涉及能够表达所述重组蛋白的表达系统及其生产和使用方法。

发明背景

脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization，CNV)是指脉络膜血管系统的不受控生长，它会在诸如弹性假黄色瘤、血管样条纹症、组织胞浆菌病、点状内层脉络膜病变、湿性年龄相关黄斑变性(AMD)等疾病中导致严重视觉丧失。湿性AMD在玻璃疣(补体成分、脂质和载脂蛋白)淀积引起受限缺血性区域，造成低氧时发生。据信，低氧导致血管内皮生长因子(VEGF)分泌增加，其活化脉络膜内皮细胞分泌基体金属蛋白酶(MMP)。金属蛋白酶降解细胞外基质，以此允许内皮细胞增殖及其向视网膜迁移。最后，MMP的作用造成新血管或CNV的形成，其能引起视网膜脱离和出血及由于血液和脂质泄漏所致的视网膜下损伤形成。在证实后，CNV是工业化国家的老年人群中视觉丧失的主要原因。

当前CNV的治疗限于患者群体的一部分，并且聚焦于抑制VEGF在血管通透性过高(hyperpermeability)和新血管形成中的有害作用。然而，VEGF还在诸如伤口愈合、光感受器存活和脉络膜毛细管床的维护等生理活动中起建设性的关键作用。当前，Ranibizumab(Lucentis^TM)，Aflibercept(Eylea^TM)和pegaptanib(Macugen^TM)是仅有的两种目前为止批准用于治疗CNV的治疗剂。这些药剂抑制VEGF。已经表明，在治疗CNV方面ranibizumab一般比pegaptanib更有效。Ranibizumab与VEGF-A所有的同种型(isoform)结合，并抑制VEGF活性，包括血管通透性和生长。除两种提及的治疗剂外，还探索了贝伐珠单抗(Avastin^TM)(ranibizumab的亲本全长抗体)作为针对CNV的标签外(off label)治疗。

尽管这些治疗在治疗CNV中获得成功，但在这些治疗上有固有的缺点，包括在活化的内皮细胞中缺乏凋亡和VEGF相关生理活动诸如伤口愈合的潜在损害。另外，ranibizumab的使用导致全身性危险，包括人玻璃体内给药之后的血栓栓塞事件率增大。玻璃体内贝伐珠单抗还与缺血性发作、血压升高、脑血管事故和死亡相联系。另外，在CNV患者的临床试验中，对ranibizumab的响应率在CNV患者中只有约40％，而且来信数目增加(gain in number of letters)仅为7.2。

因此，需要新的和/或更有效的用于治疗CNV的治疗方法，其具有降低的副作用和/或更好的治疗功效。

发明概述

本发明的某些方面提供重组蛋白，其包括连接到肿瘤抑素或其他类似的抗血管生成蛋白的运铁蛋白。在某些实施方案中，运铁蛋白和肿瘤抑素彼此直接连接。在其他实施方案中，运铁蛋白和肿瘤抑素彼此通过接头共价连接。适用的接头对于本专业技术人员是众所周知的。

本发明的其他方面提供质粒，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。通常，编码重组蛋白的核酸序列可操作连接到表达控制序列。

本发明的再其他方面提供重组核酸分子，其包括编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。在某些实施方案中，核酸序列可操作连接到表达控制序列。

本发明的再其他方面提供用重组核酸分子转染并表达重组核酸分子的重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包含连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。

本发明其他方面提供一种用于生成包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的方法，所述方法包括：

用重组核酸分子转染重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列；

在足以产生包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的条件下，培养转染的宿主细胞；并

将该重组蛋白以基本上纯化的重组蛋白回收。

在某些实施方案中，重组蛋白包括直接连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。