[发明专利]脂肪酶变体及其编码多核苷酸

说明书

涉及序列表

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发明背景

技术领域

本发明涉及具有改进的酰胺-键反应中的活性的脂肪酶变体、编码所述变体的多核苷酸、产生所述变体的方法，以及使用所述变体的方法。更具体地，本发明涉及与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)具有至少60%同源性的修饰酶，其与相应的未修饰酶相比具有改进的酰胺-键反应中的活性。

相关技术的描述

脂肪酶(三酰基甘油水解酶，EC3.1.1.3)是催化脂肪酸酯(甘油三酯)水解的丝氨酸水解酶。它们具有宽的底物特异性，可接受结构差异巨大的多种酯、醇、和羧酸作为底物。脂肪酶不催化或者难以催化酰胺的水解，这部分可以用酰胺的反应性比酯更低来解释(Bruice,P.Y.(1998)Organic Chemistry,678)。然而，已经有少数关于脂肪酶水解酰胺的报道公开：Duarte DE.,Castillo E.,Bárzana E.,&López-Munguía A.(2000)Biotechnol Lett.,22,1811-1814公开了来自南极假丝酵母的脂肪酶B对辣椒素，一种天然水不溶性酰胺的水解。Henke E.&Bornscheuer U.T.(2003)Anal Chem.,75,255-260描述了一种用于高通量测定酰胺水解的荧光测定法，其被用来评估22种未修饰的脂肪酶和酯酶，以及筛选15000种通过易错PCR和其他随机诱变方法生成的突变体。该定向进化实验未揭示阳性结果，即新的酰胺酶活性。

在另一项定向进化实验中，Fujii R.,Nakagawa Y.,Hiratake J.,Sogabe A.,&Sakata K.(2005)Protein Eng Des Sel.,18,93-101针对通过易错PCR随机产生的20000个铜绿假单胞菌脂肪酶突变体筛选改进的酰胺水解，发现了3个突变，即F207S,A213D和F265L，可影响酰胺酶/酯酶活性比。Nakagawa Y.,Hasegawa A.,Hiratake J.&Sakata K.(2007)Protein Eng Des Sel.,20,339-346描述了这项工作的后续进展，其中他们突变了铜绿假单胞菌脂肪酶以寻求更高的酰胺酶活性，并显示三重突变体F207S+A213D+M252F，而非残基M16或H83的取代，产生酰胺酶活性的增加。该项研究还试图进一步揭示为什么不水解酰胺，尽管其与能够水解酰胺的丝氨酸蛋白酶有某些相似性。二者都含有催化一个三联体，其由Ser-His-Asp/Glu以及一个氧阴离子孔构成。但是二者也有相当大的差异，表现在丝氨酸蛋白酶与铜绿假单胞菌脂肪酶之间少于30%的序列同一性。铜绿假单胞菌脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B享有的序列同一性小于30%。南极假丝酵母脂肪酶B已经是有机化学中一种确立的工具，尤其是用于酯-键反应，即酯的水解和合成以及酯交换反应。

因此，理想的是产生也能够用于催化酰胺的切割(水解)和形成的脂肪酶。本发明提供在酰胺-键反应中与亲本脂肪酶相比具有改进的活性的脂肪酶变体。

发明内容

本发明涉及亲本脂肪酶的变体，所述变体是：(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽；(b).由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的多肽；(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列具有至少60%同一性的多核苷酸所编码的多肽；或(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，其中所述变体相比于所述亲本脂肪酶具有改进的酰胺-键反应中的活性。

本发明涉及在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的S31R/K;G39;A225;T103V/S/A;L278G/K/R/H;W104Y/K/R;T42G/S/Q/H/I/L/M;D223G/N/A/V/H;I189;Q191;D134V/T/I/F/A/S/K/R;E188;V221A/R/K/H;7P38H/N/A/G;G41P/S;A132;N79;Q106;和/或L140R/K/H中的一个或多个位置上包含取代的变体。

本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。