[发明专利]源自卵翅锯角萤的荧光素酶

说明书

技术领域

本发明涉及源自卵翅锯角萤(Lucidina accensa)的荧光素酶。

背景技术

为了确定诸如细胞内信号转导和基因表达等细胞功能，已经使用诸如荧光染料和荧光蛋白等荧光探针和利用荧光素-荧光素酶反应的发光探针。特别而言，为了分析基因表达的调节，使用发光测量，这不会引起由激发光照射造成的细胞损伤或自发光问题，并且在定量确定方面非常优异。例如，在观察已导入了荧光素酶基因的细胞时，可以通过测量所述细胞的发光来确定荧光素酶基因的表达强度(更具体而言，表达量)。通过下述步骤进行发光程度的测量：将荧光素和三磷酸腺苷(ATP)等添加至通过裂解细胞而制备的裂解物中，使用包含光电倍增器的光度计对所述裂解物进行定量确定。即，在裂解细胞后测量发光，因此将在特定时间点时荧光素酶基因的表达量确定为多个细胞的总和。用于导入作为报道基因的发光基因(例如荧光素酶基因)的方法的实例是磷酸钙法、脂转染法和电穿孔法，这些方法中的每一种都根据目的和细胞类型来使用。当使用连接至待导入细胞中的荧光素酶基因上游或下游的目的DNA片段来分析荧光素酶的表达量时，能够研究该DNA片段对荧光素酶基因的转录的影响。此外，待导入细胞中的荧光素酶基因和目的基因的共表达使得能够研究基因产物对荧光素酶基因表达的影响。

为了对发光基因的表达量进行时程分析，需要测量活细胞随时间的发光程度。此类测量通过以下方式进行：在配备有光度计的温育器中进行细胞培养，并且以固定时间间隔定量确定整个细胞群的发光程度。因此，例如，可以分析具有特定周期的表达节律，并且可以获得整个细胞中发光基因的表达量的时间变化。

近年来，在生物学和医学领域中，使用图像对活样品中的动态交替变化进行时程观察的必要性越来越高。在利用荧光观察的领域中，已采用时滞拍摄或动态图像拍摄来动态地阐明蛋白分子的功能。在常规技术中，已利用荧光样品进行时程观察，例如，观察带有添加的荧光分子的蛋白的一个分子的运动图像。

相反，当使用发光样品进行时程观察时，需要使用配备有图像增强器的CCD相机，这是因为发光样品的发光强度极低。近来，已经开发出配备有用于观察发光样品的光学系统的显微镜(Jpn.Pat.Appln.KOKAI申请号2006-301599,国际公开号2006/088109)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的有用的荧光素酶。

本发明实施方式的荧光素酶源自卵翅锯角萤。

本发明提供了新型的有用的荧光素酶。

附图说明

图1是发光反应的光发射谱图，其中，在各pH环境下所使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的荧光素酶。

图2是绘出了多种荧光素酶的Km的图。

图3是比较获自发光反应的发光强度的图，其中，所使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或其突变荧光素酶，或者是源自北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶。

图4是比较本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的荧光素酶和源自北方锯角萤(L.biplagiata)的荧光素酶的抗蛋白降解稳定性的图。

图5是比较获自发光反应的发光强度的图，其中，所使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或其突变(M249K)荧光素酶，或者是源自北方锯角萤的荧光素酶。

图6是获自发光反应的光发射谱图，其中，在各pH环境下使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)。

图7是获自发光反应的光发射谱图，其中，在各pH环境下使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶(E322W)。

图8是显示出保持在55℃环境下的大肠杆菌(E.coli)的光发射的黑白图像，其中大肠杆菌表达源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)；和

图9是显示出保持在55℃环境下的大肠杆菌的光发射的黑白图像，其中大肠杆菌表达源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或突变荧光素酶(E322W)。

具体实施方式

本发明的一个实施方式涉及源自卵翅锯角萤的荧光素酶。