[发明专利]通过沉降灭活/去除凝血因子的方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种灭活源自血液、血浆或者通过重组方法获得的蛋白制剂中凝血因子的方法。

引言

凝血因子作为凝血级联系统中接触活化或内源性凝血途径的一部分，在血液凝固和血凝块形成中发挥了重要作用。有证据表明，部分凝血因子，例如FXI，在药品制造过程中可能会被激活，所以剔除或至少灭活这些激活的凝血因子显得很有必要。更优选从要用于静脉内或皮下应用的医疗制剂中除去尽可能多的凝血因子，以避免在病人中发生不良和威胁健康的血凝块形式的血栓事件。

减少混有其他蛋白质，例如免疫球蛋白或白蛋白的溶液中的FXIa或FXI的方法是已知的，但包括耗时的层析法，在使用特定的亲和树脂时，这还意味着大量的成本投入。

Bouma等;J.Biol.Chem；1977；252（18）；6432-7教导了从不含可测量（小于0.01U/ml）FXIa的血浆中提纯FXI的方法，该方法包括四个连续的层析步骤，首先为DEAE层析，接着为QAE-和SP层析，以及利用SP-葡聚糖凝胶的第二层析步骤。在某些情况中，利用刀豆蛋白A琼脂糖亲和凝胶进行额外的层析纯化来消除γ-球蛋白（免疫球蛋白G）。

Komiyama等;Thromb.Res;1992;66;397-408描述了借助FXI的固定化抗体除去血小板浓缩物中FXI/FXIa的方法。

因此，本领域迫切需要一种光谱、高效、简单的去除凝血因子的方法。

发明概述

本发明的目的提供从包含激活的凝血因子及其未激活的酶原的来源中灭活和/或除去这些蛋白质的方法。本发明公开了从含有激活的和/或未激活的凝血因子，特别是凝血因子FXIa和FXI，但也包括FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa和FX的来源中灭活和/或去除这些凝血因子的方法。感兴趣的来源包括血液或血浆或其诸组分，特别是血浆中主要含有免疫球蛋白或白蛋白作为治疗活性蛋白的诸组分。

出乎意料地发现，将含凝血因子的免疫球蛋白G（IgG）溶液与有机酸或其盐接触，同时在约0℃至约40℃的温度下、约3.5至约6.0的pH范围下搅拌，不仅FXIa被灭活或去除，其他凝血因子同样被灭活或去除。所述的有机酸可以是C₄到C₁₀，饱和的或不饱和的有机酸或其盐，特别是碱土金属的盐，如钠盐。

在本发明的一个实施方式中，有机酸为丁酸（C4），戊酸（C5），己酸（C6），庚（C7），辛酸（C8），壬酸（C9），和/或癸酸（CIO）或其盐，如钠盐。优选地，有机酸是辛酸，或它的盐是辛酸钠盐，但戊酸和癸酸的盐也认为是非常适合的。

有机酸或其盐的施用浓度为5至50mmol/L。蛋白质和有机酸或其盐搅拌45至180分钟，优选地，55至120分钟，随后将产生的沉淀物与上清液分离。搅拌时可任选使用助滤剂如硅酸盐，例如选自以下的天然产生或合成的硅酸盐：硅藻土、煅制氧化硅、珍珠岩或沸石。这种灭活或去除步骤的优势在于可以将其引入提纯源自血液的蛋白质的任何已知方法的合适之处。得到的蛋白质溶液用现有技术中已知的方法进一步处理。方法特别适合用来制造免疫球蛋白制剂。

发明详述

本发明提供从包含凝血因子的来源中灭活和/或除去此类蛋白质的方法。这种来源的例子有主要含有免疫球蛋白，特别是免疫球蛋白G（IgG抗体）或白蛋白的蛋白质溶液。本发明可避免采用去除凝血因子FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa，FX，FXI和FXIa所用的层析操作。当然，可以为其它原因而额外采用层析法纯化步骤。