[发明专利]检测G-四联体螺旋形成的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA的高级结构的检测方法。 

背景技术

人体的端粒DNA包括含有5′-TTAGGG-3′（序列编号：1）和5′-CCCTAA-3′（序列编号：2，序列编号1的互补链）的双链DNA重复的序列以及在其最末端只有5′-TTAGGG-3′（序列编号1）重复的单链DNA。该5′-TTAGGG-3′（序列编号1）重复的序列，能够形成称为G-四联体螺旋（G-quadruplex）的四链DNA结构。G-四联体螺旋中，4个鸟嘌呤形成称为G-四联体（G-quartet）的结构，这是通过π-π堆积相互作用形成的堆积结构（图1）。该G-四联体螺旋认为与细胞的癌化和寿命相关，因此近年来被着力研究。 

最近流行的利用计算机进行的全基因组分析显示，认为能够形成G-四联体螺旋的序列在基因组DNA中除了端粒DNA以外也大量存在。这些中的多数存在于包括c-kit、c-myc、H-ras、K-ras基因的原癌基因的启动子区域中。因此，对这些认为能够形成G-四联体螺旋的序列也进行着研究。以上事实暗示，G-四联体螺旋在细胞活动中具有重要的作用。 

根据以上的背景，需要简便地解析认为能够形成G-四联体螺旋的DNA是否真的能够形成G-四联体螺旋的技术。特别是，细胞内的钾离子浓度大约为100-150mM，因此，需要在该钾离子浓度条件下解析G-四联体螺旋的形成的技术。因此，进行了与单链DNA或双链DNA相比，与G-四联体螺旋反应时发出特别强的荧光的化合物（以下，称为G-四联体螺旋探针）的探索。换言之，G-四联体螺旋探针必须具有与单链DNA或双链DNA反应时几乎不发出荧光、但是与G-四联体螺旋反应时发出强烈的荧光的性质。 

近年来，花精力最多的研究的G-四联体螺旋探针之一为苯并噻唑衍生物。苯并噻唑衍生物的研究盛行的原因在于，苯并噻唑衍生物水溶性高，荧光强度变化非常大。例如，在非专利文献1中，报道了使用了Cyan40（化1）和Cyan2（化2）的G-四联体螺旋检测技术。该报道显示，在钾离子不存在的条件下，使Cyan2与G-四联体螺旋反应时，与双链DNA反应的情况相比，发出更强的荧光。但是，也显示在100mM钾离子存在下，即使Cyan2与G-四联体螺旋反应也几乎检测不到荧光。因此，Cyan2在钾离子存在下的G-四联体螺旋检测中无法使用。此外，在非专利文献2中，报道了使用噻唑橙（化3）（以下，称为TO）的G-四联体螺旋检测技术。该报道显示，TO在100mM钾离子的存在下，与G-四联体螺旋反应则发出强烈的荧光。但是，相同条件下，TO与双链DNA反应时，比TO与G-四联体螺旋反应时发出更强的荧光。因此，在100mM钾离子的存在下，无法使用TO特异性检测出G-四联体螺旋。 

（化1） 

（化2） 

（化3） 

如上所述，近年来，将苯并噻唑衍生物作为G-四联体螺旋探针使用，进行着特异性检测G-四联体螺旋的技术的开发。但是，在与细胞内同样条件的钾离子存在的条件下能够特异性检测G-四联体螺旋的技术仍是未知的。 

现有技术文献 

非专利文献 

非专利文献1：J.Flucresc.,2011,21(1),223-230 

非专利文献2：J.Am.Chem.Soc.,2006,128(36),11890-11893 

非专利文献3：J.Am.Chem.Soc.,2006,128(30),9963-9970 

非专利文献4：Nucleic Acids Res.,2006,34(19),5715-5719 

发明内容

发明所要解决的课题 

简便地解析在钾离子的存在下认为能够形成G-四联体螺旋的DNA是否真的能够形成G-四联体螺旋的技术非常有用。因此，着力研究着使用苯并噻唑衍生物的G-四联体螺旋检测技术的研究，但是没有开发出在钾离子存在下特异性检测G-四联体螺旋的技术。因此，本发明的发明人进行了深入研究，结果发现，在钾离子的存在下，硫代黄素T（化4）与G-四联体螺旋反应时发出强烈的荧光。该荧光强度与硫代黄素T与双链DNA或单链DNA反应时相比，明显更强。因此，根据本发明，发现了即使在钾离子的存在下也能够特异性检测G-四联体螺旋。 

（化4） 

用于解决课题的方法 

解决上述课题的本发明为一种判定靶DNA在钾离子存在下是否 形成了G-四联体螺旋的方法，其具备以下的工序：