[发明专利]来源于灰盖鬼伞菌的漆酶2基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属微生物基因工程领域，涉及一种来源于灰盖鬼伞菌（Coprinopsis cinereaokayama）的漆酶2基因及其应用。

背景技术

漆酶（EC1.10.3.2）是一种含铜的氧化还原酶，属于氧化酶的蓝铜家族（Eur J Biochem187:341-352）。漆酶的应用范围很广，目前研究它的应用主要集中在它降解各种化工染料(J Ind Microbiol Biotechnol31:127-132)、芳香族类化合物（Microbial Cell Factories5:31）以及二酚、多酚类化合物（Process Biochemistry45:507-513）的功能。除此之外，漆酶在不同的物种发挥不同的功能：在昆虫中，它们参与甲壳的硬化；在植物中，参与细胞壁形成，还与木质素化和去木质素有关；在芽孢杆菌中，则是和抗紫外线的孢子组装有关；在一些植物致病性真菌利用这类酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用。众所周知，漆酶给工业生产方面带来了巨大的贡献。大量的漆酶基因从植物（J Chem Soc43：472）、动物（万云洋，博士论文，武汉大学）和微生物（Microbiology148：4003–4014）中分离出来，进行了系统的研究。

在NCBI数据库中，收集了很多微生物的全基因组的信息，其中编码蛋白的序列都被注释了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注释蛋白的功能可以完善这些酶学，并运用到工业应用中去。

灰盖鬼伞菌属于层菌纲家族，是亚洲很受欢迎的药用菌类。它的化学成分已经研究的相当透彻。虽然灰盖鬼伞菌有8个漆酶基因，但是来自灰盖鬼伞菌的漆酶2的生理生化特性研究和对染料的脱色效果的研究目前还没有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于灰盖鬼伞菌（Coprinopsis cinereaokayama）的漆酶2基因及其应用。即通过化学合成方法得到所述的漆酶2基因，并将其应用于真核生物中进行表达和纯化，研究其生理生化特性和对甲基橙、结晶紫和孔雀石绿的脱色效果。

所述的漆酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No1所示，它是根据毕氏酵母密码子偏爱通过化学合成方法制得的。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成（PTDS）（Nucleic Acids Research,2004,32：e98）。该方法是通过重叠延伸获得合成基因的片段，再通过最外侧的引物将全长的基因扩增得到。该方法的一个明显优势就是不需要对引物进行磷酸化处理。而且通过高通量的DNA合成仪器，可以较为便利地获得大量的引物。

所述的漆酶2基因，其具体合成方法如下：

1、根据毕氏酵母密码子偏爱设计引物

设计长度大概为60mer左右的覆盖整个漆酶2基因的寡核苷酸的序列50个，作为引物。利用PCR进行漆酶2基因扩增，在100μl反应体系中，P2~P29共48个引物的添加量为2ng，外侧引物P1和P50添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，72℃10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共30个循环。

PCR结束后，1%琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化于DH5α感受态中，获得长度为1500bp的阳性克隆，即为本发明的漆酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID No2所示。

将上述制得的漆酶2基因转入真核生物细胞中。即将该漆酶2基因直接与真核表达载体pYM7909（Molecular Biology Report，2012Apr;39(4):3807-14）相连，经过DH5α克隆过的环形质粒单酶切使其线性化，取约1μl的线性DNA与80μl毕赤酵母感受态细胞混合后进行点击转化，然后涂布于固体SD山梨醇培养基（20g/L琼脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD）上，28℃继续培养3天后获得白色菌落。挑取经测活呈阳性的毕赤酵母进行细胞外分泌表达纯化，即获得纯化后的漆酶2基因蛋白。然后对其进行酶动力学特性分析和生理生化特性分析。

实验结果证明，本发明合成的漆酶2基因是一类应用非常广泛的生物用酶，通过克隆，可以高效人工合成，通过对该基因真核表达和纯化，可以将其应用于染料脱色工业生产中。

附图说明

图1为本发明的以pYM7909质粒构建DNA表达单元的结构示意图。