[发明专利]一种海洋微生物来源的海藻糖合成酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种海洋微生物来源的海藻糖合成酶及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖是一种稳定的非还原性二糖，广泛存在于细菌、真菌、酵母、昆虫和多种植物体内。由两个吡喃环葡萄糖以α-1,1-糖苷键连结而成，海藻糖有3种光学异构体，其中αα型海藻糖是最常见的海藻糖。αβ和ββ型在自然界中很少存在，αα型海藻糖结构式如式(I)所示。

海藻糖的化学性质稳定。口感略带甜味。其理化性质稳定，不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，但能被海藻糖酶水解为两个葡萄糖分子。海藻糖在生物体内具有保护作用，它能在低温、脱水、高温、氧化应激等极端条件下保护生物大分子免于损害。海藻糖由于其特殊的性质，在生物医药、食品、化妆品行业有广泛的应用前景。

早期的海藻糖制备方法包括化学合成法和微生物抽提法，特别是酵母提取法曾经是海藻糖的主要商品生产方式。但通过这些方法生产海藻糖制造成本过高，价格昂贵，近年来己经逐步被淘汰。

酶法生产海藻糖已逐步成为海藻糖生产的主要方式。目前在生物体内共发现有五条海藻糖生物合成途径，其中有三条途径被详细研究。第一条途径是TPS-TPP途径，是生物体内分布最为广泛的一种合成海藻糖的途径。但由于底物有高能磷酸物质：葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖，价格昂贵，不适合工业化生产（Pan YT et al.Trehalose-phosphate synthase of Mycobacterium tuberculosis.Cloning,expression and properties of the recombinant enzyme.Eur J Biochem2002,269:6091-6100）。第二条途径（TreY-TreZ）是利用淀粉或麦芽寡聚糖为底物，首先在麦芽寡糖基海藻糖合成酶（TreY）的作用下生成麦芽寡聚海藻糖，接着在麦芽寡糖基海藻糖基海藻糖水解酶（TreZ）的作用下再生成海藻糖。1994年日本林原生化研究所首次发明了通过这两种酶生产海藻糖的方法，该方法以淀粉为底物，在TreY和TreZ的协同作用，由淀粉直接生产海藻糖。配合其它淀粉水解酶，海藻糖转化率可达70%。目前，世界上已有少数几家公司掌握该途径生产海藻糖的方法(Nakada T et al.Purification and properties of a novel enzyme,maltooligosyl trehalose synthase,from Arthrobacter sp.Q36.Biosci Biotechnol Biochem1995,59:2210-2214)。第三条途径是TreS途径，是由TreS基因编码的海藻糖合成酶通过分子内转糖基作用，一步反应催化麦芽糖与海藻糖间的相互转化(Nishimoto T,et al.Purification and properties of a novel enzyme,trehalose synthase,from Pimelobacter sp.R48.Biosci Biotechnol Biochem1996,60:640-644)。

第二，三条途径在自然界的微生物中广泛存在，有多个菌属含有上述单酶或双酶系，但多存在于极端环境微生物及古细菌中，或是在极端环境下诱导生成。关于海藻糖生成和代谢机制的研究一直是极端微生物((Extremophiles)研究的热点课题。但海藻糖合成酶基因的编码特征特殊，在异源生物中不易表达，或表达量偏低，因此虽然有大量论文发表，但很少有依据基因工程表达申报的专利公开，据此推测相关技术尚待研究开发。

经过联网检索，关于海藻糖的酶法转化共检索到多个专利。南宁中诺生物工程有限责任公司公开的一种海藻糖合成酶，在40L发酵罐水平上表达，以27.27%的麦芽糖为底物，转化时间32h，转化率70%，是目前国内生产海藻糖的主要方法（发明名称为“谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法”，公开号为CN1563371A）。广西大学公开一种的来源于褐色喜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的海藻糖合成酶（发明名称为“T.fusca海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法”，公开号为CN1563372A）以麦芽糖浆为底物,可产生40－70%的海藻糖。