[发明专利]一种利用糖化酶筛选高产柠檬酸菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种利用糖化酶筛选高产柠檬酸菌株的方法。

背景技术

在我国的柠檬酸行业中，利用淀粉质原料，以黑曲霉（Aspergillusniger）为菌种深层发酵生产柠檬酸的水平已达到世界先进水平。其生产工艺为先将淀粉质原料粉碎、加α-淀粉酶将淀粉液化分解为短链的糊精，取其液化液加适量有机氮源进行发酵，发酵醪液经过提取后获得柠檬酸。黑曲霉可以自身分泌糖化酶，并且该糖化酶可以耐受酸性环境。黑曲霉利用糖化酶对短链的糊精进行分解获得葡萄糖，葡萄糖进入EMP途径，经三羧酸循环获得柠檬酸。

柠檬酸菌种进行生产筛选时的主要指标是摇瓶产酸。其筛选流程为平板分离后，单菌落接入试管，将成熟的孢子接入摇瓶培养基中，在96小时检测摇瓶产酸，选取摇瓶高产酸的编号试管进行传代用于发酵生产。

在柠檬酸发酵生产中经常发现，当应用不同批次菌种时，会出现产酸及残糖的区别。排除发酵过程中通气、搅拌罐压等控制因素的影响，研究发现，不同批次菌种筛选结果中，每一只试管斜面接种培养基后，其糖化酶的活力不同。当淀粉质原料经α-淀粉酶液化后，糖化酶活力强的试管菌株产生的发酵菌球可以快速的分泌糖化酶，从而将短链糊精较快的分解为葡萄糖供给菌体进行发酵产酸。而分泌糖化酶慢或糖化酶活力较弱的菌株，将短链糊精分解为葡萄糖的速度较慢，这会导致柠檬酸发酵产酸速度较慢。当柠檬酸一旦积累，发酵醪液的pH值迅速下降。如果糖化酶的耐酸性较弱，分解短链糊精的速度将大为下降，到发酵终点时，发酵醪液中残糖较高不能被利用。因此，在发酵开始后，柠檬酸产生菌黑曲霉的糖化酶的活力是影响柠檬酸产酸速率与发酵残糖的重要因素。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明目的是提供一种利用糖化酶筛选高产柠檬酸菌株的方法。

为实现本发明的目的，本发明的主要技术路线如下：通过测定柠檬酸发酵过程中糖化酶和柠檬酸含量，筛选柠檬酸高产菌株。

具体地，通过测定24小时、36小时的发酵醪液中的糖化酶含量和测定96小时的发酵醪液中的柠檬酸含量来筛选糖化酶与柠檬酸产生量高的柠檬酸高产菌株。

上述技术方案具体包括以下步骤：

（1）将黑曲霉孢子接入柠檬酸发酵摇瓶中，发酵培养；

（2）将24小时、36小时发酵醪液中菌丝体过滤，测定滤清液中糖化酶含量；

（3）将96小时发酵醪液中菌丝体过滤，测定滤清液中柠檬酸含量；

（4）筛选糖化酶与柠檬酸产生量高的柠檬酸高产菌株。

其中，筛选糖化酶含量高的柠檬酸高产菌株的标准为糖化酶含量：24小时酶活力大于2500u/100ml、36小时酶活力大于1800u/100ml。筛选柠檬酸含量高的柠檬酸高产菌株的标准为：96小时柠檬酸的含量大于15g/100ml。

优选地，24小时酶活力2500-2800u/100ml、36小时酶活力1800-2000u/100ml。筛选柠檬酸含量高的柠檬酸高产菌株的标准为：96小时柠檬酸的含量15-16g/100ml。

其中，步骤（1）中黑曲霉孢子的发酵培养为常规方法培养。黑曲霉菌株包括各种不同来源的黑曲霉菌株。

发酵培养基的配方例子为：所述的培养基为玉米粉按22%的质量百分比用自来水配制；在1L发酵培养基中加α-淀粉酶0.1~0.5mL，由水浴锅控制液化温度，分段液化（65℃保温45min，然后升温至90℃后保温，直至终点），以碘液不变色为液化终点。过滤后得液化清液。其中，所述玉米液化液中含糖量15~16%。发酵培养基中加入总重量10~14%的玉米蛋白粉为有机氮源。

培养条件的例子为：发酵条件为温度36-39℃，摇瓶转速为350-400r/min，培养时间96h。

本发明的积极效果在于：本发明中所述方法进行柠檬酸菌株的筛选，发酵菌株性能稳定，发酵前期产糖较快，柠檬酸积累速度较快，尤其突出表现为发酵终点发酵残糖低，残总糖在1.0%以下。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。黑曲霉菌株(ATCC16404)购自广东省微生物研究所。

实施例1菌种分离