[发明专利]一种猪肺炎支原体的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及支原体培养的技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体的培养方法。

背景技术

猪肺炎支原体可以引起猪气喘病，该病是一种接触性慢性呼吸道传染病。猪感染后会降低饲料转化率，影响生长发育，并引起其他病毒及细菌的继发感染。由猪肺炎支原体所引起的猪气喘病普遍存在于养殖业发达的国家，该病一直以来是困扰我国养殖业发展的重要疾病。据统计，2010年我国生猪出栏近6亿头，90％以上养殖基地和规模化养猪场都存在着感染猪肺炎支原体的风险，国内该病的感染率可高达80%，是造成我国养猪业经济损失的重要传染病之一。目前疫苗免疫是预防本病的最主要手段。据资料报道，在发达国家，猪支原体肺炎的免疫率达70%，而我国由于进口疫苗价格昂贵，猪群免疫率不足10％，年经济损失达300多亿元人民币，严重影响了养猪业的经济效益。目前，我国在动物疫苗技术研发与世界先进水平相比还存在较大差距，猪肺炎支原体的培养难度很大，传统的培养方式耗时长，并且滴度不高，是目前支原体疫苗规模化生产的技术瓶颈。

针对猪支原体肺炎疫苗生产现状，我们开展了改进猪支原体肺炎疫苗制备方法的研究，从生产工艺方面做了大量的探索、研究试验，最终获得了重大突破。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪肺炎支原体的培养方法。

目前，培养猪肺炎支原体是按照以下步骤进行的：

1．培养基配方：种子液和制苗用菌液均用此培养基。

PPLO培养基

灭活猪血清（200ｍＬ／Ｌ）

酵母浸出液（10ｍＬ／Ｌ）

青霉素20万单位

葡萄糖（4ｇ／Ｌ）

用ＮａＯＨ调ｐＨ至8.0。

2.猪肺炎支原体菌株鉴定标准

猪肺炎支原体种子培养物及生产培养物均用显微镜检查其形态，镜下体积小，呈现多形性，在制备一个新生产种子时，需要检验培养物特有的生化及免疫化学特性，典型的反应为葡萄糖反应阳性、甘露糖反应阳性、精氨酸反应阴性、尿素酶反应阴性、猪肺炎支原体抗血清一致生长实验阳性。用免疫荧光标记的猪肺炎支原体抗体作直接荧光抗体实验为阳性。

3.种子液的制备：

3.1一级种子繁殖及鉴定

启封冷冻菌种，用培养基将其融化复原，然后以10%（v/v）的量接种于培养基中，37℃培养15-96h，纯检合格后作为一级种子备用。

3.2二级种子繁殖及鉴定

取一级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，37±2℃培养15-96h，纯检合格后作为二级种子备用。

3.3种子罐制备

取二级种子按接种量10%（v/v）接种于培养基中，温度控制37±2℃，通气培养15-96h，纯检合格后备用。

4、菌液制备

以合格的种子液按5%-20%（v/v）的量接种到培养基，PH值8.0±0.5，温度控制37±2℃，纯检和活菌计数，一直到所需的量。

按此方法生产，一般需要培养70-96个小时后才能达到109CCU/ml，并需要经过不定时的对培养液进行测定PH值，这样操作在大规模生产猪支原体肺炎疫苗时会带来较高风险的污染，并耗时较长，并对操作人员要求较高，生产难度大，产量低、成本高。

为了解决目前现有技术中存在的问题，本发明提出了一种新的用于猪肺炎支原体的培养方法，具体包括以下步骤：

（1）种子液的制备：

①一级种子繁殖及鉴定

启封冷冻菌种，用培养基将其融化复原，然后以10%（v/v）的量接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，37℃培养15-96h，纯度检验合格后作为一级种子备用；

②二级种子繁殖及鉴定

取一级种子按接种量10%（v/v）接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，37±2℃培养15-96h，纯度检验合格后作为二级种子备用；

③种子罐制备

取二级种子按接种量10%（v/v）接种于含有4ml/L酚红的PPLO培养基中，温度控制37±2℃，通气培养15-96h，纯度检验合格后备用；

（2）菌液制备

以合格的种子液按5%-20%（V/V）的量接种到含有4ml/L酚红的PPLO培养基，pH值8.0±0.5，温度控制37±2℃，通气培养，并每12h加入1mol/L NaOH将PPLO培养基pH调至8.0，纯度检验和活菌计数，至所需支原体浓度的量。

在本发明中，优选的所述的含有4ml/L酚红的PPLO培养基的组分为：