[发明专利]一种高效表达乳酸脱氢酶C4的工程菌及其表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组乳酸脱氢酶C4的工程菌及其表达方法。

背景技术

乳酸脱氢酶（LDH），是糖酵解途径中的一个酶，利用NADH为辅酶，催化丙酮酸和乳酸之间的转化。在哺乳动物中，LDH有3个编码基因，分别为LDH-A、LDH-B、LDH-C，编码A、B、C三个亚基（E.Goldberg,Reproductive implications of LDH-C4and other testis-specific isozymes,Exp.Clin.Immunogenet.2(1985)120-124.），对应的四聚体纯合酶为乳酸脱氢酶M4（LDH-M4）、乳酸脱氢酶H4（LDH-H4）和乳酸脱氢酶C4（LDH-C4），其中LDH-M4主要存在于骨骼肌中，LDH-H4主要存在于心肌，而LDH-C4只出现在成熟睾丸和精子中，这三种四聚体纯合酶在生化性质上也有较大的区别（C.L.Markert,J.B.Shaklee,G.S.Whitt,Evolution of a gene.Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure,function and regulation,Science189(1975)102-114.），LDH-C4相对于LDH-M4和LDH-H4在溶液中具有更好的热稳定性，其还能催化一些碳链较短的a-酮酸和a-羟酸之间的转化，因而可以用于化工领域生产高纯度L-乳酸和一些a-羟酸（L.Schatz,H.L.Segal,Reduction of alpha-ketoglutarate by homogeneous lactic dehydrogenase X of testicular tissue.J Biol Chem.1969,244:4393-7.）。

LDHC4广泛应用于临床诊断（用于检测转氨酶的活性）和化工生产，如果从天然动物组织中分离纯化LDHC4，会受到来源的限制，分离纯化的成本也较高，用基因工程的方法制备是一种很好的解决办法。

国内有通过基因工程的方法来表达LDH-C基因的文献，但表达出的C亚基不能形成四聚体，不能得到LDH-C4，故没有活性或者活性不高。国外也有通过大肠杆菌表达人LDH-C基因来获得LDH-C4的报道，但是表达活性较低，粗酶的酶活最高仅为0.5U/mg，纯化后酶的酶活最高仅为106U/mg（K.M.LeVan,E.Goldberg,Properties of human testis-specific lactate dehydrogenase expressed from Escherichia coli.Biochem J.1991,273:587-92.）。

发明内容

为了给临床诊断、化工生产提供酶活高的LDH-C4，本发明提供了一种通过基因工程的手段重组表达LDH-C4的方法，为了实现重组表达，提供了一种新的核苷酸序列，以及含有该序列的重组载体和重组菌。

本发明提供的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明重组载体包括SEQ ID NO.1或所示的核苷酸序列。优选地，所述重组载体是pET32a重组载体。

本发明重组菌，它包括前述的重组载体。优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌。

本发明制备重组蛋白的方法，它包括如下步骤：

（1）取前述的重组菌，在大肠杆菌培养基中培养，诱导表达，得菌液，离心，得菌体；

（2）取步骤（1）所得菌体，裂解，离心，取上清，分离纯化，即得。

步骤（1）所述培养基为含有氨苄霉素的LB液体培养基中振摇培养，培养温度为37℃，诱导表达使用的诱导剂为IPTG，诱导温度为25℃，诱导时间为10h。

其中，步骤（2）所述分离纯化采用蓝胶亲和柱层析与离子交换层析。

本发明从鼠兔睾丸中LDH-C编码基因出发，用基因工程的方法制备得到了重组乳酸脱氢酶C4（LDH-C4），其粗酶酶活高达35U/mg，纯化后的酶活高达478U/mg，是现有重组乳酸脱氢酶C4纯品酶活的4.5倍，热稳定性和酸碱稳定性强，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。