[发明专利]腹水型抗体的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及一种腹水型抗体的纯化方法。

背景技术

单克隆抗体是哺乳动物包括人类B淋巴细胞所分泌的一类能与致病原特异性结合并发生免疫应答的免疫球蛋白。单克隆抗体已广泛应用于生物学和医学研究领域。鼠源单克隆抗体的主要用途包括：1.作为研究工作中的探针或亲和层析的配体，用于生物学及医学的研究以及工业纯化；2.作为医学检验试剂或动植物病原、食物毒素或添加剂等的检测试剂，用于实验室、临床诊断试剂的开发。

大量生产鼠源单抗的方法主要有两种：一是体外培养杂交瘤细胞，再从细胞上清中分离纯化抗体。二是将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔使其形成腹水。前一种方法效率很低，抗体浓度低、分离困难，成本高，但是没有鼠源性的杂质的干扰。后一种方法生产快、抗体浓度高、抗体容易纯化，但是需要使用较多小鼠，不适合大规模工业化制备，实验室最常使用。腹水的制备过程比较简单，提前一周用弗氏不完全佐剂0.5ml注射小鼠腹腔，注射佐剂后一周将生长旺盛的杂交瘤细胞注射小鼠腹腔，一般7天~10天左右就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时可以用注射器反复抽采腹水，直至小鼠死亡。腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的蛋白成份等杂质，需进一步纯化。

抗体的各种用途往往对抗体本身的纯度要求较高。尽管抗体纯化方法较多，如传统的DEAE离子交换色谱法、盐析/沉淀法、蛋白A或蛋白G纯化、抗原亲和纯化等，但在很多情况下纯化效率均不理想，或操作复杂、成本过高不适合中小实验室使用。

盐析/沉淀法主要有两种，硫酸铵沉淀法和辛酸-硫酸铵沉淀法。硫酸铵沉淀法的原理是在高浓度的盐离子条件下（一般是中性盐），蛋白质分子在水溶液中，分子表面的水化膜被会剥夺，从而析出溶液，表现为溶解度减小而析出。通常用的盐主要是硫酸铵，在45%饱和条件下，免疫球蛋白溶解度最小而析出，同时腹水中的一些杂蛋白也会析出，因此抗体纯度不是很高。辛酸-硫酸铵两步沉淀法得到的抗体更纯，其原理是：辛酸是一种有机酸，在酸性条件下(pH4.5)，可以使大分子蛋白质沉淀，尤其是等电点（PI）值在4.5附近的白蛋白，将这些杂蛋白用辛酸沉淀完毕后，再用45%饱和硫酸铵将抗体沉淀下来即可，但是抗体的纯度也不是很高。

发明内容

鉴于此，有必要提供一种能够提高腹水型抗体纯度的纯化方法。

一种腹水型抗体的纯化方法，包括如下步骤：

步骤一：在4℃将小鼠腹水离心，取清液；

步骤二：在所述清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释，再搅拌加入饱和的硫酸铵溶液，直至饱和度达到45%~50%，静置析晶后，经离心，得到沉淀物；

步骤三：在所述沉淀物中加入磷酸盐缓冲液溶解，得到的溶液经0.45微米滤膜过滤，使用葡聚糖凝胶G25脱盐柱脱盐，使用磷酸盐缓冲液进行平衡和洗脱，收集蛋白溶液；及

步骤四：将所述蛋白溶液上样至ProteinA/G亲和柱上，并用磷酸盐缓冲液将杂蛋白从所述ProteinA/G亲和柱上洗脱，然后用甘氨酸-盐酸溶液将抗体从所述ProteinA/G亲和柱上洗脱，得到抗体溶液。

在其中一个实施例中，步骤一中，所述小鼠腹水的离心步骤包括：先将所述腹水于1500转/分钟~2000转/分钟离心10分钟~20分钟，取清澈液体，再将所述清澈液体于10000转/分钟~12000转/分钟离心30分钟~40分钟，取上清液，即得到所述清液。

在其中一个实施例中，步骤二中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为7.0。

在其中一个实施例中，在所述清液中加入磷酸盐缓冲液进行稀释时，所述清液与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1~1:2。

在其中一个实施例中，步骤四中，所述甘氨酸-盐酸溶液的浓度为0.1mol/L，pH为2.7。

在其中一个实施例中，步骤四之后还包括在所述抗体溶液中加入1mol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液进行中和。

在其中一个实施例中，加入所述Tris-HCl缓冲溶液进行中和之后，还包括使用50KD超滤管离心浓缩抗体，再加入0.15mol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。

上述腹水型抗体的纯化方法，通过将硫酸铵沉淀法与ProteinA/G亲和柱层析相结合对腹水型抗体进行纯化，大幅度的提高了抗体的纯度，使得抗体的纯度大于90%。

附图说明

图1为一实施方式的腹水型抗体的纯化方法流程图；