[发明专利]利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基。

背景技术

小麦是一种在世界各地广泛种植的重要粮食作物，它关系到国家的经济危机和粮食安全。中国是世界最大的小麦生产国。2010年继玉米和水稻之后，小麦在中国的产量达到了224万吨。目前，通过常规育种手段提高小麦产量和品质的努力已是举步维艰，尤其在挖掘亩产潜力、保证年产稳定性等方面。自1992年Vasil等将gus/bar基因导入小麦获得首例转基因小麦以来，遗传改良育种在小麦上的研究有了长足的发展。2008年国家将小麦的遗传改良加入重大转基因专项，正在积极稳妥地推动实施转基因小麦新品种的培育工作。小麦遗传转化常用的方法有基因枪法和农杆菌介导法。由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，所以基因枪法一直是小麦转化的主要方法。

尽管到目前为止一些国外公司和实验室能够利用基因枪法获得稳定遗传的转基因小麦，但普遍具有转化效率低、转化周期长、体细胞变异多、逃逸现象严重、仅适用于“Bobwhite”“Fielder”等国外品种的技术缺陷和不足。1995年Zhou等用预培养5天的“Bobwhite”未成熟胚基因枪法导入gus/cp4基因。整个转化周期长达4-5个月，草铵膦阳性植株占轰击外植体的比例平均为0.15%，其中1/3的植株能够表达gus基因。1996年Ortiz等用包裹含有gus/hpt基因的质粒轰击预培养7-9天的“BuckOmbú”未成熟胚，仅愈伤筛选阶段长达4-6周并且8个转化植株中就有4个逃逸。2000年Jordan实验室利用GFP辅助筛选大大提高了小麦基因枪转化频率，最高可达5%。2002年Hubert等借助bar基因，GFP辅助筛选手段，使商品小麦品种“Combi”的转化频率达到了4.93%，比常规愈伤转化高出38倍。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种获得转基因小麦的成套培养基，包含如下分别独立包装的四种培养基中的四种、任意三种、任意两种或任意一种：培养基A、培养基B、培养基C和培养基D；

所述培养基A(即高渗培养基)是由MS基本培养基、甘露醇、2,4-D、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基；所述甘露醇在所述培养基A中的浓度可为80-100g/L（如90g/L）；所述2,4-D在所述培养基A中的浓度可为4.5—5.5mg/L（如5.0mg/L）；

所述培养基B（即诱导培养基）是由MS基本培养基、2,4-D、硫酸铜、水解酪蛋白、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基；所述2,4-D在所述培养基B中的浓度可为2.0-3.0mg/L(如2.0mg/L),所述硫酸铜在所述培养基B中的浓度可为0.5-0.7mg/L(如0.6mg/L),所述水解酪蛋白在所述培养基B中的浓度可为0.4—0.6g/L(如0.5g/L)；

所述培养基C（即分化培养基）是由MS基本培养基、激动素、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基，或由MS基本培养基、激动素、蔗糖、凝固剂和筛选剂制成的固体培养基；所述激动素在所述培养基C中的浓度可为0.2—0.3mg/L（如0.2mg/L）；

所述培养基D（即生根培养基）是由1/2的MS基本培养基、乙磺酸、α-萘乙酸、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基，或由1/2的MS基本培养基、乙磺酸、α-萘乙酸、蔗糖、凝固剂和筛选剂制成的固体培养基；所述乙磺酸在所述培养基D中的浓度可为0.4—0.6g/L（如0.5g/L），所述α-萘乙酸在所述培养基D中的浓度可为0.4—0.6mg/L（0.5mg/L）；

所述MS基本培养基为表1所示的培养基。

在上述成套培养基中，所述蔗糖在所述培养基A、B、C和D中的浓度可为20—40g/L（如30g/L）；

和/或，所述凝固剂为植物凝胶，所述植物凝胶在所述培养基A、B、C和D中的浓度可为3g/L；

和/或，所述培养基A、B、C和D的pH值可为5.6—5.8（如5.8）。

本发明的另一个目的是提供一种利用基因枪获得转基因小麦的方法，包括如下步骤：

1）取小麦幼胚用所述培养基A进行培养；

2）使用基因枪对经步骤1）所述培养的小麦幼胚进行轰击，将目的DNA导入所述小麦幼胚细胞中；

3）将经步骤2）所述轰击的小麦幼胚用所述培养基A进行培养；

4）将经步骤3）所述培养的小麦幼胚用所述培养基B进行培养获得愈伤组织；

5）将步骤4）获得的愈伤组织用所述培养基C进行分化培养，获得含目的DNA的转基因小麦植株。