[发明专利]P450sca-2酶突变体、其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域。更具体地，本发明涉及P450sca-2酶突变体、其制备方法、以及其在从美伐他汀制备普伐他汀中的应用。

背景技术

高脂血症正在不断的威胁着人们的健康，因此降血脂药的开发成为制药行业的一个重要目标。普伐他汀(pravastatin)是一种非常重要的降血脂药(Tsujita Y等,1986,Biochim.Biophys.Acta 877,50-60;Koga T等,1990,Biochim.Biophys.Acta 1045,115-120)。普伐他汀钠的工业生产是两步发酵过程，包括从橘青霉(Penicillium citrinum)发酵生产美伐他汀(mevastatin)，经过浓碱处理制成美伐他汀钠，最后利用微生物转化的方法将美伐他汀钠羟基化制成普伐他汀钠(Serizawa N.,1996 Biotechnol.Annu.Rev.2,373-389)。

嗜碳链霉菌(Streptomyces carbophilus)具有较强将美伐他汀钠羟基化制备普伐他汀钠的能力，广泛用于普伐他汀的工业生产(Serizawa N.,1996Biotechnol.Annu.Rev.2,373-389)。通过对此羟基化过程的机理进行研究，发现其中起主要催化作用的酶属于细胞色素P450酶系，根据其来源命名为P450sca(Matsuoka T等,1989,Eur.J.Biochem.184,707-713)。从嗜碳链霉菌中共纯化出两种P450sca酶，分别命名为P450sca-1酶和P450sca-2酶。这两种P450sca酶具有类似的分子量(46±1 kDa)和氨基酸组成(疏水氨基酸含量46-47%)。P450sca-2在催化美伐他汀转化为普伐他汀中的比活性高于P450sca-1的比活性，并且其易于被纯化，因此P450sca-2被普遍应用于生物发酵法制备普伐他汀中。

然而，目前通过生物发酵法制得的普伐他汀的产率较低，因此需要更高效的P450sca-2酶来提高普伐他汀的产率。

发明内容

一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其是SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶的变体或所述变体的生物学活性片段，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代，而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶，所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。

在一个实施方式中，所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V，且所述多肽包括SEQ ID NO:2所示的序列。

在另一个实施方式中，所述多肽的氨基酸序列进一步包括在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的选自T119、N363、T85、V194和它们任意组合的位置上的氨基酸取代。

在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119和N363位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363、T85和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、N363、T85和V194位置上。

在一个实施方式中，所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H。在一个实施方式中，所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N。在一个实施方式中，其中所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T。