[发明专利]乙肝e抗原的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乙肝e抗原的纯化方法。

背景技术

传统的乙肝e抗原主要来自感染者的血清，来源困难，每个批次的抗原效价具有差异，作用效果稳定性差，生产人员具有一定的操作风险，且难以纯化。

随着分子生物学的发展，出现了许多利用基因工程技术制备乙肝e抗原的方法，通过构建基因工程菌，大量生产乙肝e抗原。然而，这些基因工程技术生产的乙肝e抗原存在产品效价差，免疫原性低等问题，并且，基因工程菌产物中除了乙肝e抗原，还包括多种杂质。

在乙肝e抗原在达到药学或免疫学上可接受的要求之前需要去除杂质，这些杂质一般包括基因工程菌其他代谢产物，如蛋白或DNA分子，以及乙肝e抗原的变体或错误折叠的形式。这些杂质在给药或免疫过程中可能会引起过敏性反应而对产物的安全性产生负面影响。这些杂质在不同的色谱模式可能具有宽泛的停留模式，因此去除较困难，通常需要涉及多个不同的色谱纯化的步骤。

通常的乙肝e抗原纯化方法大多基于乙肝e抗原蛋白和杂质之间在大小、电荷及溶解性上的差异来进行选择，主要方法包括亲和色谱、离子交换色谱、体积排阻色谱和疏水相互作用色谱等。这些方法存在一定的技术瓶颈，如离子交换和疏水相互作用色谱等技术可能在洗脱过程中因为蛋白质浓度的增加、缓冲液浓度的变化或pH值的变化造成目标产物乙肝e抗原活性的改变。

另外，在多种情况下，目标产物与杂志在等电点上显示出的差异太小，通过离子交换色谱无法将它们进行分离。体积排阻色谱的操作步骤繁琐，且存在对目标产物严重稀释的不足，不适合大规模，高效率的乙肝e抗原生产工艺。亲和色谱易发生渗漏，导致对洗脱目标产物的污染。

近年来出现的融合标签技术，利用亲和纯化定向设计目标蛋白，与纯化基质不发生任何直接相互作用，避免这种直接的相互作用导致目标产物的活性变化。现有技术中用GST（Glutathione S-transferase，谷胱甘肽巯基转移酶）融合乙肝e抗原，但是GST的相对分子量为26000，对乙肝e抗原的蛋白结构产生影响，在达到药学或免疫学上应用的要求前要将GST标签去除，操作繁琐，去除GST标签的乙肝e抗原还需重新进行纯化去除新的杂质。

开发减少操作步骤，并且不破坏或降低乙肝e抗原蛋白活性的纯化方法成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种乙肝e抗原的纯化方法，包括以下步骤：

将含有重组乙肝e抗原基因的重组质粒转入细菌本体，得到重组细菌，所述重组乙肝e抗原基因包括乙肝e抗原基因和连接于乙肝e抗原基因5’端或3’端的多聚组氨酸编码基因；

加入诱导剂进行重组细菌培养；

将重组细菌裂解，并将裂解液进行离心，收集离心所得上清液，将离心所得沉淀用高浓度变性剂溶解制备沉淀溶解液；

将固定化金属螯合亲和层析介质与上清液或沉淀溶解液在允许多聚组氨酸融合乙肝e抗原结合或吸附至所述介质的条件下接触；

从所述介质选择性洗脱所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原。

优选地，在洗脱之前还包括以下步骤：在所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原保持与所述介质结合的条件下清洗所述结合的介质。

优选地，所述清洗的步骤包括用至少一种多聚组氨酸融合乙肝e抗原清洗缓冲液清洗所述结合的介质，其中所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原清洗缓冲液包含100至200mmol/L NaCl和30至100mmol/L Tris，pH范围在6.5-7.5。

优选地，所述细菌本体选自Escherichia coli，Shigella sonnei，Shigelladysenteriae，Shingella flexneri，Salmonella typhimurium，Salmonellaenterica，Enterobacter aerogenes，Serratia marcescens，Yersinia pestis，或者Klebsiella pneumoniae。

优选地，所述重组质粒由重组乙肝e抗原基因转入原核表达质粒形成。

优选地，所述介质为载有过渡态金属离子的固定化金属螯合亲和层析介质。

优选地，所述过渡态金属离子为Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺或Co²⁺。

优选地，所述诱导剂为IPTG，所述重组细菌的培养温度为37℃，培养时间为3h。